Saggio ibrido di ensemble e singola molecola per l'imaging del movimento di CMG completamente ricostituito

Studiamo la dinamica del moto di diversi componenti del replosoma eucariotico a livello di singola molecola. Al fine di ottenere una profonda comprensione quantitativa di come le cellule possono duplicare il loro intero genoma, ad ogni ciclo cellulare. In una scoperta nel 2015, la replicazione del DNA eucariotico è stata completamente ricostituita in vitro da componenti proteici purificati.

E questo ci ha dato un grande controllo sul sistema. E da allora, è stato ampiamente utilizzato per rispondere a domande sulle diverse fasi della replicazione del DNA con risoluzione temporale e spaziale crescente. E questo è stato fatto utilizzando approcci complementari come la crioterapia EM e la biofisica a singola molecola.

Nel campo delle singole molecole, una delle maggiori sfide con questo sistema è il numero di proteine coinvolte e anche le concentrazioni alle quali questi componenti sono necessari per massimizzare l'efficienza della reazione complessiva, perché ciò può complicare l'imaging della singola molecola. Il protocollo qui descritto introduce un approccio ibrido in cui un complesso proteico viene prima assemblato in modo efficiente utilizzando la biochimica d'insieme prima di essere introdotto e studiato in un contesto di singola molecola. In questo modo si evita l'introduzione di due alte concentrazioni proteiche a livello di singola molecola.

Illustriamo questo approccio per studiare il comportamento dell'elicasi replicativa CMG sul DNA a livello di singola molecola dopo il suo assemblaggio attraverso la via basata sull'origine. Ma questo approccio può essere utilizzato anche per studiare la dinamica di molti altri tipi di complessi proteici leganti il DNA.