Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes del movimiento de la CMG totalmente reconstituida

Estudiamos la dinámica de movimiento de diferentes componentes del replisoma, eucariota, a nivel de una sola molécula. Con el fin de obtener una comprensión cuantitativa profunda de cómo las células pueden duplicar sus genomas completos, en cada ciclo celular. En un gran avance en 2015, la replicación del ADN eucariota se reconstituyó completamente in vitro a partir de componentes de proteínas purificadas.

Y esto nos dio mucho control sobre el sistema. Y desde entonces, se ha utilizado ampliamente para responder preguntas sobre las diferentes etapas de la replicación del ADN con una resolución temporal y espacial cada vez mayor. Y esto se hizo utilizando enfoques complementarios como la crioelectromagnética y la biofísica de moléculas individuales.

En el campo de una sola molécula, uno de los mayores desafíos con este sistema es la cantidad de proteínas involucradas y también las concentraciones en las que se requieren estos componentes para maximizar la eficiencia de la reacción general, ya que esto puede complicar la obtención de imágenes de una sola molécula. El protocolo descrito aquí introduce un enfoque híbrido en el que un complejo de proteínas se ensambla primero de manera eficiente utilizando la bioquímica de conjuntos antes de ser introducido y estudiado en un entorno de una sola molécula. Esto evita la introducción de dos altas concentraciones de proteína a nivel de una sola molécula.

Ilustramos este enfoque para estudiar el comportamiento de la helicasa replicativa CMG en el ADN a nivel de molécula única después de su ensamblaje a través de la vía basada en el origen. Pero este enfoque también se puede utilizar para estudiar la dinámica de muchos otros tipos de complejos de proteínas de unión al ADN.