Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Ökaryotik replizomun farklı bileşenlerinin hareket dinamiklerini tek molekül düzeyinde inceliyoruz. Hücrelerin tüm genomlarını, her hücre döngüsünü nasıl kopyalayabileceklerine dair derin bir nicel anlayış elde etmek için. 2015 yılında bir atılımda, ökaryotik DNA replikasyonu, saflaştırılmış protein bileşenlerinden in vitro olarak tamamen yeniden oluşturuldu.

Ve bu bize sistem üzerinde çok fazla kontrol sağladı. Ve o zamandan beri, artan zamansal ve mekansal çözünürlükle DNA replikasyonunun farklı aşamaları hakkındaki soruları yanıtlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ve bu, kriyo EM ve tek molekül biyofiziği gibi tamamlayıcı yaklaşımlar kullanılarak yapıldı.

Tek molekül alanında, bu sistemle ilgili en büyük zorluklardan biri, ilgili proteinlerin sayısı ve aynı zamanda genel reaksiyonun verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için bu bileşenlerin gerekli olduğu konsantrasyonlardır, çünkü bu, tek moleküllü görüntülemeyi karmaşıklaştırabilir. Burada açıklanan protokol, bir protein kompleksinin ilk olarak topluluk biyokimyası kullanılarak verimli bir şekilde bir araya getirildiği, daha sonra tek bir molekül ortamında tanıtıldığı ve incelendiği hibrit bir yaklaşım sunar. Bu, tek molekül seviyesinde iki yüksek protein konsantrasyonunun ortaya çıkmasını önler.

Bu yaklaşımı, replikatif helikaz CMG'nin, köken tabanlı yol yoluyla bir araya getirilmesini takiben tek molekül düzeyinde DNA üzerindeki davranışını incelemek için gösteriyoruz. Ancak bu yaklaşım, diğer birçok DNA bağlayıcı protein kompleksinin dinamiklerini incelemek için de kullanılabilir.