Hybrid-Ensemble und Einzelmolekül-Assay zur Abbildung der Bewegung von vollständig rekonstituiertem CMG

Wir untersuchen die Bewegungsdynamik verschiedener Komponenten des eukaryotischen Replisoms auf der Ebene einzelner Moleküle. Um ein tiefes quantitatives Verständnis dafür zu erlangen, wie Zellen ihr gesamtes Genom, jeden Zellzyklus, duplizieren können. In einem Durchbruch im Jahr 2015 wurde die eukaryotische DNA-Replikation in vitro aus gereinigten Proteinkomponenten vollständig rekonstituiert.

Und das gab uns eine Menge Kontrolle über das System. Und seitdem wird es ausgiebig eingesetzt, um Fragen zu verschiedenen Stadien der DNA-Replikation mit zunehmender zeitlicher und räumlicher Auflösung zu beantworten. Und dies geschah mit komplementären Ansätzen wie Kryo-EM und Einzelmolekül-Biophysik.

Im Einzelmolekülbereich ist eine der größten Herausforderungen bei diesem System die Anzahl der beteiligten Proteine und auch die Konzentrationen, bei denen diese Komponenten benötigt werden, um die Effizienz der Gesamtreaktion zu maximieren, da dies die Einzelmolekül-Bildgebung erschweren kann. Das hier beschriebene Protokoll führt einen hybriden Ansatz ein, bei dem ein Proteinkomplex zunächst auf effiziente Weise mit Hilfe der Ensemble-Biochemie zusammengesetzt wird, bevor er dann in einer Einzelmolekülumgebung eingeführt und untersucht wird. Dadurch wird die Einführung von zwei hohen Proteinkonzentrationen auf Einzelmolekülebene vermieden.

Wir veranschaulichen diesen Ansatz, um das Verhalten der replikativen Helikase-CMG auf der DNA auf Einzelmolekülebene zu untersuchen, nachdem sie über den ursprungsbasierten Signalweg assembliert wurde. Dieser Ansatz kann aber auch verwendet werden, um die Dynamik vieler anderer Arten von DNA-bindenden Proteinkomplexen zu untersuchen.