우리는 단일 분자 수준에서 진핵생물 replisome의 다양한 구성 요소의 운동 역학을 연구합니다. 세포가 어떻게 전체 게놈, 모든 세포 주기를 복제할 수 있는지에 대한 심층적인 정량적 이해를 얻기 위해. 2015년의 돌파구로, 진핵생물 DNA 복제는 정제된 단백질 성분으로부터 시험관 내에서 완전히 재구성되었습니다.
이를 통해 시스템에 대한 많은 제어력을 얻을 수 있었습니다. 그리고 그 이후로, 시간적, 공간적 해상도가 증가함에 따라 DNA 복제의 여러 단계에 대한 질문에 답하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 그리고 이것은 cryo EM 및 단일 분자 생물 물리학과 같은 보완적인 접근 방식을 사용하여 수행되었습니다.
단일 분자 분야에서 이 시스템의 가장 큰 과제 중 하나는 관련된 단백질의 수와 단일 분자 이미징을 복잡하게 만들 수 있기 때문에 전체 반응의 효율성을 극대화하기 위해 이러한 구성 요소가 필요한 농도입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 단백질 복합체를 먼저 앙상블 생화학을 사용하여 효율적인 방식으로 조립한 다음 단일 분자 환경에서 도입 및 연구하는 하이브리드 접근 방식을 소개합니다. 이것은 단일 분자 수준에서 두 가지 높은 단백질 농도의 도입을 방지합니다.
우리는 기원 기반 경로를 통해 조립된 후 단일 분자 수준에서 DNA에 대한 복제 헬리카제 CMG의 거동을 연구하기 위한 이 접근 방식을 설명합니다. 그러나 이 접근법은 다른 많은 유형의 DNA 결합 단백질 복합체의 역학을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
