Badamy dynamikę ruchu różnych składników replikomu eukariotycznego na poziomie pojedynczej cząsteczki, aby uzyskać dogłębne ilościowe zrozumienie, w jaki sposób komórki mogą powielać całe swoje genomy w każdym cyklu komórkowym. Przełomowym odkryciem w 2015 roku było to, że replikacja eukariotycznego DNA została w pełni odtworzona in vitro z oczyszczonych składników białkowych, co dało nam dużą kontrolę nad systemem. Od tego czasu jest szeroko stosowany do odpowiadania na pytania dotyczące różnych etapów replikacji DNA z rosnącą rozdzielczością czasową i przestrzenną.
Dokonano tego przy użyciu uzupełniających się podejść, takich jak krio-EM i biofizyka pojedynczych molekuł. W dziedzinie pojedynczych cząsteczek jednym z największych wyzwań związanych z tym systemem jest liczba zaangażowanych białek, a także stężenia, przy których te składniki są wymagane, aby zmaksymalizować wydajność całej reakcji, ponieważ może to skomplikować obrazowanie pojedynczej cząsteczki. Opisany tutaj protokół wprowadza podejście hybrydowe, w którym kompleks białkowy jest najpierw składany w efektywny sposób przy użyciu biochemii zespołowej, a następnie wprowadzany i badany w warunkach pojedynczej cząsteczki.
Pozwala to uniknąć wprowadzania zbyt wysokich stężeń białek na poziomie pojedynczej cząsteczki. Ilustrujemy to podejście do badania zachowania replikacyjnej helikazy CMG na DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki po jej złożeniu za pośrednictwem szlaku opartego na pochodzeniu. Ale to podejście może być również wykorzystane do badania dynamiki wielu innych typów kompleksów białkowych wiążących DNA.
Przystąp do przeprowadzenia reakcji po funkcjonalizacji obu końców liniowego substratu DNA. Najpierw weź kolumny wirujące S400 i wiruj je przez co najmniej 30 sekund, aby ponownie zawiesić żywicę. Następnie odwirować je przez jedną minutę w temperaturze 735 G w celu usunięcia buforu magazynującego.
Przenieś kolumny do czystych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów podwójnie funkcjonalizowanego liniowego roztworu DNA do każdej kolumny. Wirować kolumny przez dwie minuty w temperaturze 735 G, aby przepuścić DNA przez kolumnę, zachowując nieinkorporowane nukleotydy.
Po zebraniu przepływu zawierającego DNA z czterech kolumn, zmierz objętość za pomocą pipety. Następnie wiruj kulki magnetyczne pokryte streptawidyną M280 przez 30 sekund, aby je ponownie zawiesić. Przenieś cztery miligramy zawieszonych kulek magnetycznych do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby zebrać koraliki przed wyjęciem bufora do przechowywania. Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu A, wirując przez pięć sekund, a następnie inkubując kulki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zbierz koraliki, umieszczając rurkę w uchwycie magnetycznym na jedną minutę.
Po usunięciu buforu A ponownie zawiesić kulki w 400 mikrolitrach 2x buforu A przez pipetowanie. Następnie dodaj 400 mikrolitrów funkcjonalizowanego roztworu DNA do kulek i delikatnie wymieszaj pipetując. Inkubuj mieszaninę koralików-DNA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem od końca do końca.
Następnego dnia użyj stojaka magnetycznego, aby usunąć supernatant przed obliczeniem całkowitej ilości DNA związanego z kulkami magnetycznymi. Następnie przemyj kulki sekwencyjnie buforem B i buforem C. Ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach buforu C i wykonaj cztery porcje po 75 mikrolitrów. Na początek weź jedną 75-mikrolitrową porcję zawierającą jeden miligram kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną związaną z DNA i usuń supernatant za pomocą stojaka magnetycznego.
Umyj koraliki 200 mikrolitrami bufora ładującego. Następnie ponownie zanurz kulki w 75 mikrolitrach bufora ładującego i delikatnie wymieszaj pipetując. Następnie dodaj kompleks rozpoznawania pochodzenia o końcowym stężeniu 37,5 nanomola do DNA związanego z kulkami i inkubuj reakcję przez pięć minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem 800 obrotów na minutę.
Dodać Cdc6 o końcowym stężeniu 50 nanomolowych i inkubować reakcję, jak pokazano wcześniej. Następnie dodać Mcm2-7/Cdt1 w końcowym stężeniu 100 nanomolowych i inkubować reakcję przez 20 minut, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj Ddk w końcowym stężeniu 100 nanomolowych i inkubuj podobnie przez 30 minut.
Po usunięciu supernatantu przemyj DNA związane z kulkami zawierające fosforylowane heksamery Mcm2-7 za pomocą 200 mikrolitrów buforu do płukania o wysokiej zawartości soli. Miesza się przez pipetowanie, upewniając się, że kulki są całkowicie zawieszone. Następnie usuń bufor i umyj kulki raz 200 mikrolitrami buforu CMG.
Aby złożyć i aktywować znakowany fluorescencyjnie CMG na DNA związanym z kulkami, usuń bufor CMG i ponownie zawieś kulki związane z DNA w 50 mikrolitrach buforu CMG uzupełnionego pięciomilimolowym ATP. Następnie wymieszaj wszystkie składniki wymienione na ekranie w jednej tubce i umieść ją na lodzie. Natychmiast dodaj zawieszone DNA związane z kulkami do mieszanki białek.
Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem 800 obr./min. Płukać koraliki sekwencyjnie buforem HSW i buforem CMG. Po usunięciu buforu ponownie zawiesić CMG zawierające kulki magnetyczne związane z DNA w 200 mikrolitrach buforu elucyjnego.
Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę z mieszaniem 800 obr./min. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i pozwól na zebranie koralików przez pięć minut. Ostrożnie zebrać supernatant zawierający eluowane kompleksy DNA-CMG bez przerywania osiadłych kulek i przenieść go do nowej probówki.
Aby upewnić się, że w roztworze nie pozostały żadne kulki, należy ponownie umieścić zebrany supernatant w stojaku magnetycznym i przechowywać przez kolejne pięć minut. Ostrożnie zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki. Dodać 1 400 mikrolitrów buforu CMG do 200 mikrolitrów supernatantu.
Próbka jest teraz gotowa do obrazowania pojedynczej cząsteczki. Wykonaj obrazowanie pojedynczej cząsteczki w komercyjnym zestawie łączącym pęsetę optyczną z podwójną wiązką z mikroskopią konfokalną. Użyj kanału pierwszego do wstrzykiwania do wychwytywania kulek, kanału drugiego do wiązania kompleksu białek DNA, kanału trzeciego do sprawdzania obecności CMG, a kanałów czwartego i piątego jako rezerwuarów białka i miejsc wymiany.
Wszystkie roztwory należy wlać do komory przepływowej pod stałym ciśnieniem 0,5 bara w króćcu wtryskowym. Następnie wyłącz przepływ w kanałach czwartym i piątym. Po wstępnym przepłynięciu wszystkich roztworów zmniejszyć ciśnienie do 0,2 bara.
Przesuwaj lasery pułapkujące tak, aby kierowały jeden, aż jedna koralik zostanie złapana w każdą pułapkę optyczną. Przesuń uwięzione koraliki do kanału drugiego, przesuwając joystick podczas naciskania spustu. Używając joysticka bez naciskania spustu, wyłowić kompleks DNA-CMG, przesuwając prawy koralik w kierunku i od lewego koralika, aż zostanie uwięziona więź DNA.
Przesuń koraliki do kanału trzeciego i natychmiast zatrzymaj przepływ we wszystkich kanałach. Dostosuj moc lasera 561 nm do czterech mikrowatów w panelu lasera wzbudzenia, a następnie wykonaj jednoklatkowy skan testowy DNA w kanale trzecim. Jeśli jest obecny, CMG pojawi się jako dwuwymiarowe punkty ograniczone dyfrakcją.
W takim przypadku przenieś linkę DNA na kanał czwarty lub piąty w celu obrazowania. W przeciwnym razie ponownie włącz przepływ, wyrzuć koraliki i powtórz kroki. W kanałach czwartym lub piątym wprowadź dwa piconewtony w panelu spektroskopii sił i kliknij przycisk włączania, aby uruchomić zacisk siły.
Gdy początkowe napięcie osiągnie dwa pikonewtony, wyłącz zacisk siły przed obrazowaniem, klikając ponownie przycisk włączania w panelu spektroskopii sił. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie w panelu skanowania obrazu. Obraz fluorescencyjnego CMG co pięć sekund za pomocą lasera o długości 561 nm o mocy czterech mikrowatów, mierzonej na obiektywie.
W reakcji wolnej od agregacji, CMG pojawiło się jako dyskretne, symetryczne plamki ograniczone dyfrakcją, z trudem zagęszczające DNA. Wręcz przeciwnie, agregaty są mniej dyskretne, czasami asymetryczne plamy tłoczą się na większej długości DNA. Jeśli test został pomyślnie przeprowadzony i osiągnięto wysoką czystość oczyszczonych białek, można było zaobserwować ruch CMG na duże odległości w obecności ATP.
