Ensemble hybride et dosage d’une seule molécule pour imager le mouvement d’une CMG entièrement reconstituée

Nous étudions la dynamique du mouvement de différents composants du réplisome eucaryote au niveau de la molécule unique. Afin d’obtenir une compréhension quantitative approfondie de la façon dont les cellules peuvent dupliquer l’ensemble de leur génome, à chaque cycle cellulaire. Lors d’une percée en 2015, la réplication de l’ADN eucaryote a été entièrement reconstituée in vitro à partir de composants protéiques purifiés.

Et cela nous a donné beaucoup de contrôle sur le système. Et depuis lors, il a été largement utilisé pour répondre à des questions sur les différentes étapes de la réplication de l’ADN avec une résolution temporelle et spatiale croissante. Et cela a été fait en utilisant des approches complémentaires telles que la cryo-EM et la biophysique des molécules uniques.

Dans le domaine des molécules uniques, l’un des plus grands défis de ce système est le nombre de protéines impliquées et les concentrations auxquelles ces composants sont nécessaires afin de maximiser l’efficacité de la réaction globale, car cela peut compliquer l’imagerie de la molécule unique. Le protocole décrit ici introduit une approche hybride dans laquelle un complexe protéique est d’abord assemblé de manière efficace à l’aide de la biochimie d’ensemble avant d’être ensuite introduit et étudié dans un cadre de molécule unique. Cela permet d’éviter l’introduction de deux concentrations élevées de protéines au niveau d’une seule molécule.

Nous illustrons cette approche pour étudier le comportement de la CMG hélicase réplicative sur l’ADN au niveau de la molécule unique suite à son assemblage via la voie basée sur l’origine. Mais cette approche peut également être utilisée pour étudier la dynamique de nombreux autres types de complexes protéiques de liaison à l’ADN.