פרוטוקול זה נועד לבודד ולטהר שלפוחיות חוץ-תאיות בין-תאיות של שרירי השלד ברקמות שריר מכרסמים. שלפוחית חוץ-תאית זו תספק תובנות יקרות ערך לגבי מנגנון מחלת המצב האנושי בשריר עם יישום פוטנציאלי כסמנים ביולוגיים אבחוניים וכלי טיפול. פרוטוקול סטנדרטי זה יאפשר ניתוח והשוואה של מאפיינים של EV שמקורו בשרירי השלד על פני דגימות שריר שונות, כולל תפוקה, גודל, הרכב המטען ותפקודו.
תוצאות אלה יקדמו את הבנתנו את תפקידם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, וכן יקלו על היישום של כלי רכב חשמליים אלה כסמנים ביולוגיים אבחנתיים. המעבדה שלנו תתמקד בייצור אמין של בועיות חוץ-תאיות בין-תאיות של שרירי השלד בצורה יעילה ויעילה בזמן. אנו שואפים לחקור את תפקידם הפתולוגי ואת הפוטנציאל הטיפולי שלהם, במיוחד בהקשר של הפרעות נוירומוסקולריות.
כדי להתחיל, אבטחו את רגל העכבר המורדמת בצלחת סטרילית כאשר הצד הקדמי של הרגל פונה כלפי מעלה. באמצעות מספריים דיסקציה, לבצע חתך קטן של חמישה מ"מ בעור בצד לרוחב של קרסול העכבר. הכנס להב אחד של המספריים לתוך החתך, מיקום אותו מתחת לעור, אבל מעל רקמת השריר.
לאחר מכן, חתכו את העור כלפי מעלה לכיוון הברך כדי להאריך את החתך. השתמש בפינצטה גסה כדי לתפוס את העור לאורך החתך ולמשוך אותו לאחור כדי להרחיב את הפתח, עד שהשריר הופך גלוי. כעת, אתרו את שריר הטיביאליס הקדמי, או שריר TA, העובר מהברך ועד הקרסול, לאורך הצד הלטרלי של עצם השוקה.
השתמשו בפינצטה מושחזת כדי לתפוס ולקלף בזהירות את רקמת החיבור המכסה את שריר ה-TA. בקרבת הקרסול יש לזהות את גיד TA המחובר לשריר TA ואת גיד EDL הקטן יותר, הממוקם בסמוך לגיד TA בצד הצידי. השתמשו במספריים לדיסקציה כדי לקטוע את שני הגידים.
השתמש בפינצטה גסה כדי לתפוס את שני הגידים. בעזרת זוג פינצטה נוסף, מפרידים בזהירות את הגידים, ומבודדים את ה-TA מה-EDL. לאחר מכן, הרימו את שריר ה-TA על ידי הגיד הטרי שנקטע באמצעות פינצטה מחוספסת.
השתמש מספריים דיסקציה לחתוך את גיד TA ליד הברך, הסרת השריר. כעת, שחררו את הרגל והפכו את העכבר כך שהצד האחורי של הרגל פונה כלפי מעלה. כאשר חלק מהעור כבר הוסר, השתמש במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את העור שנותר ליד הקרסול.
תפסו את העור החתוך בפינצטה גסה וקילפו אותו כלפי מעלה לכיוון החלק האחורי של הברך, תוך חשיפת שריר הגסטרוקנמיוס. השתמש מספריים דיסקציה כדי לחתוך את גיד gastrocnemius ליד הקרסול. אחזו בגיד הגסטרוקנמיוס בפינצטה גסה והרימו אותו כלפי מעלה כדי לחשוף את החלק התחתון של שריר הגסטרוקנמיוס.
לאחר מכן, אתר את גיד הסולאוס הקטן יותר מתחת לגסטרוקנמיוס, קרוב לברך, שם הגסטרוקנמיוס עדיין מחובר. השתמש במספריים דיסקציה כדי לקטוע את גיד הסולאוס ולאפשר לשריר הסולאוס להתכווץ כלפי מעלה. אחזו בגיד הסולאוס הקטוע בפינצטה חדה והרימו אותו בעדינות כדי לנתק את שריר הסולאוס מהחלק התחתון של הגסטרוקנמיוס.
השתמש מספריים דיסקציה כדי לקטוע את קצה הסוליאוס, שם הוא מתחבר לקצה קטוע של gastrocnemius, מפריד לחלוטין את שני השרירים. בעזרת מספריים לדיסקציה, חותכים את קצה הגסטרוקנמיוס ליד הברך ומניחים אותו ב-PBS על קרח. לאחר הסרת ארבעת השרירים מתחת לברך, הפוך את העכבר כך שהצד הקדמי פונה כלפי מעלה.
מקם את רגל העכבר בזווית של 90 מעלות כדי לאלץ את שריר הארבע ראשי להתגמש. השתמש במספריים דיסקציה כדי לקטוע את הגיד הקרוב ביותר לברך. לאחר מכן, כדי להפריד את הארבע ראשי מעצם הירך, חתכו בין השריר לעצם עד שרק הגיד הפרוקסימלי נשאר מחובר.
חותכים את הגיד הפרוקסימלי באמצעות מספריים לדיסקציה, ומסירים את הארבע ראשי. שטפו את כל השרירים שהוסרו מספר פעמים עם PBS כדי להסיר מזהמים כגון פרווה ודם. יבשו בעדינות את השרירים באמצעות מגבות נייר.
התחילו בהסרה עדינה של הגידים מדגימת השריר באמצעות פינצטה חדה, פינצטה, אזמל או מספריים. לאחר מכן, באמצעות מספריים או אזמל, חותכים את השריר לאורך סיבי השריר מגיד אחד למשנהו, לחתיכות בעובי מילימטר. להכנת מאגר אנזימי עיכול, יש לערבב שני מיליגרם של collagenase, שני אנזימים למיליליטר DMEM עם תמיסת סטרפטומיצין 1%פניצילין.
לאחר הערבוב, סנן את התמיסה דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. מפרידים את רקמת השריר לאליציטוטים, שכל אחד מהם מכיל 20 מיליגרם שריר. הוסף מיליליטר אחד של החיץ המוכן לכל aliquot עבור דיסוציאציה אנזימטית ודגירה.
הכינו ותייגו צינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים בקוטר 1.5 מיליליטר. הגדר מסנן 0.45 מיקרומטר על ידי הסרת הבוכנה ממזרק חמישה מיליליטר. הברג את רכזת המזרק לקצה העליון של מסנן 0.45 מיקרומטר ומקם את הקצה התחתון של המסנן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן.
לאחר מכן, צנטריפוגו את התערובת במשך 10 דקות ב 1000 גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי פסולת כדורית. השתמש במיקרופיפטה P-200 כדי להעביר את הסופרנאטנט לתוך המזרק. לאחר הכנסת הבוכנה מחדש למזרק, דחפו באיטיות את הסופרנאטנט דרך המסנן, ואפשרו לו להיאסף בצינור המיקרוצנטריפוגה המסומן 1.5 מיליליטר.
הסר שוב את בוכנת המזרק. באמצעות מיקרופיפטה P-200, להוסיף כ 200 מיקרוליטר של PBS לתוך המזרק. הכנס מחדש את הבוכנה ודחוף באיטיות את 200 המיקרוליטרים של PBS דרך המסנן כדי לשטוף את כל הסופרנאטנט שנותר לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה המסומן.
העבר את הפתרון המסונן לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים של 1.5 מיליליטר, המתאימים למהירויות של עד 200, 000 גרם.לאחר סגירת הצינורות, מקם אותם ברוטור של מיקרו אולטרה-צנטריפוגה כדי להבטיח שהם מאוזנים. הפעל את מיקרו ultracentrifuge ולהגדיר אותו לפעול במשך שעה אחת ב 100, 000 G וארבע מעלות צלזיוס. מניחים את הרוטור הטעון עם הצינורות בתוך מיקרו אולטרה צנטריפוגה.
סגור את המכסה והפעל את השואב כדי להתחיל את התהליך. ברגע ששואב האבק מגיע לרמה שתיים, לחץ על לחצן התחל והמתן להשלמת תהליך הצנטריפוגה. לאחר השלמת מחזור הצנטריפוגה, לחץ על לחצן הוואקום כדי ללחוץ מחדש על התא לפני הסרת הרוטור והצינורות.
הסר בזהירות את הסופרנאטנט מכל צינור באמצעות מיקרופיפטה P-200. לאחר מכן, השתמש באותו מיקרופיפטה P-200 כדי להוסיף 50 מיקרוליטר של PBS לכל צינור.
