이 프로토콜은 설치류 근육 조직에서 골격근 간질성 세포외 소포체를 분리하고 정제하는 것을 목표로 합니다. 이 세포외 소포체는 진단 바이오마커 및 치료 수단으로 응용할 수 있는 잠재적인 응용 프로그램과 함께 근육, 인간 상태, 질병 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 이 표준화된 프로토콜은 수율, 크기, 화물 구성 및 기능을 포함한 다양한 근육 샘플에서 골격 근육 유래 EV의 특성을 분석하고 비교할 수 있도록 합니다.
이러한 결과는 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 EV의 역할에 대한 이해를 증진시키고 이러한 EV를 진단 바이오마커로 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 우리 실험실은 효율적이고 시간 효율적인 방식으로 고순도 및 고수율 골격근 간질 세포외 소포체를 안정적으로 생산하는 데 중점을 둘 것입니다. 우리는 특히 신경근 장애의 맥락에서 그들의 병리학적 역할과 치료 잠재력을 탐구하는 것을 목표로 합니다.
시작하려면 안락사된 쥐 다리를 다리의 앞쪽이 위쪽을 향하도록 멸균 플레이트에 고정합니다. 해부 가위를 사용하여 마우스 발목 측면의 피부를 5mm의 작은 절개를합니다. 가위의 한쪽 날을 절개 부위에 삽입하여 피부 아래에 위치하지만 근육 조직 위에 위치시킵니다.
그런 다음 피부를 무릎 쪽으로 위쪽으로 잘라 절개 부위를 확장합니다. 끝이 거친 핀셋을 사용하여 절개 부위의 피부를 잡고 뒤로 당겨 근육이 보일 때까지 입구를 넓힙니다. 이제 경골의 측면을 따라 무릎에서 발목까지 이어지는 경골 전방 또는 TA 근육을 찾습니다.
날카로운 핀셋을 사용하여 TA 근육을 덮고 있는 결합 조직을 잡고 조심스럽게 벗겨냅니다. 발목 근처에서 TA 근육에 연결된 TA 힘줄과 측면의 TA 힘줄 옆에 위치한 더 작은 EDL 힘줄을 식별합니다. 해부 가위를 사용하여 양쪽 힘줄을 절단하십시오.
끝이 거친 핀셋을 사용하여 양쪽 힘줄을 잡습니다. 다른 핀셋을 사용하여 힘줄을 조심스럽게 분리하여 EDL에서 TA를 분리합니다. 그런 다음 거친 핀셋을 사용하여 갓 절단한 힘줄로 TA 근육을 들어 올립니다.
해부 가위를 사용하여 무릎 근처의 TA 힘줄을 절단하여 근육을 제거합니다. 이제 다리를 놓고 다리의 뒤쪽이 위쪽을 향하도록 마우스를 뒤집습니다. 피부의 일부를 이미 제거한 상태에서 해부 가위를 사용하여 발목 근처의 나머지 피부를 자릅니다.
거친 핀셋으로 잘린 피부를 잡고 무릎 뒤쪽으로 위쪽으로 벗겨 비복근을 노출시킵니다. 해부 가위를 사용하여 발목 근처의 비복 힘줄을 절단하십시오. 끝이 거친 핀셋으로 비복근 힘줄을 잡고 위로 들어 올려 비복근의 아래쪽을 노출시킵니다.
그런 다음 비복근이 여전히 연결되어 있는 무릎에 가까운 비복근 아래의 더 작은 가자미 힘줄을 찾습니다. 절개 가위를 사용하여 가자미 힘줄을 절단하여 가자미 근육이 위쪽으로 수축할 수 있도록 합니다. 끝이 뾰족한 핀셋으로 절단된 가자미근을 잡고 부드럽게 들어 올려 비복근 아래쪽에서 가자미근을 분리합니다.
해부 가위를 사용하여 가자미의 끝 부분을 절단하면 비복근의 절단 된 끝에 부착되어 두 근육을 완전히 분리합니다. 해부 가위를 사용하여 무릎 근처의 비복 끝을 자르고 얼음 위의 PBS에 넣습니다. 무릎 아래 4개의 근육을 제거한 후 앞쪽이 위를 향하도록 마우스를 뒤집습니다.
마우스 다리를 90도 각도로 배치하여 대퇴사두근이 구부러지도록 합니다. 해부 가위를 사용하여 무릎에 가장 가까운 힘줄을 절단하십시오. 그런 다음 대퇴골에서 대퇴사두근을 분리하기 위해 근위 힘줄만 붙어 있을 때까지 근육과 뼈 사이를 자릅니다.
절제 가위를 사용하여 근위 힘줄을 절단하고 대퇴사두근을 제거합니다. 제거된 모든 근육을 PBS로 여러 번 헹구어 털과 혈액과 같은 오염 물질을 제거합니다. 종이 타월을 사용하여 근육을 부드럽게 말리십시오.
날카로운 핀셋, 파편 핀셋, 메스 또는 가위를 사용하여 근육 샘플에서 힘줄을 부드럽게 제거하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 가위나 메스를 사용하여 한쪽 힘줄에서 다른 힘줄까지 근육 섬유를 따라 세로로 근육을 1mm 두께의 덩어리로 자릅니다. 소화 효소 완충액을 준비하려면 콜라겐 분해 효소 2mg, DMEM 1밀리리터당 효소 2개를 1% 페니실린 스트렙토마이신 용액과 혼합합니다.
혼합 후 0.2마이크로미터 필터를 통해 용액을 여과합니다. 근육 조직을 각각 20mg의 근육을 함유하는 부분 표본으로 분리합니다. 준비된 완충액 1mL를 효소 해리를 위해 각 부분 표본에 추가하고 배양합니다.
새 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다. 5밀리리터 주사기에서 플런저를 제거하여 0.45마이크로미터 필터를 설정합니다. 주사기 허브를 0.45마이크로미터 필터의 상단 끝에 나사로 고정하고 필터의 하단 끝을 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
그런 다음 혼합물을 1000G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다. P-200 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 주사기로 옮깁니다. 플런저를 주사기에 다시 삽입한 후 필터를 통해 상층액을 천천히 밀어 라벨이 부착된 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 모일 수 있도록 합니다.
주사기 플런저를 다시 제거합니다. P-200 마이크로피펫을 사용하여 약 200마이크로리터의 PBS를 주사기에 추가합니다. 플런저를 다시 삽입하고 필터를 통해 200마이크로리터의 PBS를 천천히 밀어 남아 있는 상층액을 라벨이 부착된 마이크로 원심분리기 튜브로 씻어냅니다.
200, 000 G.After까지 속도를 위해 적당한 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 관에 걸러진 해결책을 옮기고, 균형을 잡는다는 것을 지키기 위하여 마이크로 초원심분리기의 회전자에 그(것)들을 두십시오. 마이크로 초원심 분리기를 켜고 100, 000G 및 섭씨 4도에서 1 시간 동안 작동하도록 설정하십시오. 로드된 로터를 튜브와 함께 마이크로 초원심분리기 내부에 놓습니다.
뚜껑을 닫고 진공 청소기를 켜서 프로세스를 시작합니다. 진공이 레벨 2에 도달하면 시작 버튼을 누르고 원심분리 과정이 완료될 때까지 기다립니다. 원심분리 주기가 완료된 후 로터와 튜브를 제거하기 전에 진공 버튼을 클릭하여 챔버를 재가압합니다.
P-200 마이크로피펫을 사용하여 각 튜브에서 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 동일한 P-200 마이크로피펫을 사용하여 각 튜브에 50마이크로리터의 PBS를 추가합니다.
