Questo protocollo mira a isolare e purificare le vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico nei tessuti muscolari dei roditori. Questa vescicola extracellulare fornirà preziose informazioni sul meccanismo della malattia dello stato umano muscolare con potenziali applicazioni come biomarcatori diagnostici e veicoli terapeutici. Questo protocollo standardizzato consentirà l'analisi e il confronto delle caratteristiche delle EV derivate dal muscolo scheletrico tra diversi campioni muscolari, tra cui la resa, le dimensioni, la composizione del carico e la funzione.
Questi risultati miglioreranno la nostra comprensione del loro ruolo in vari processi fisiologici e patologici e faciliteranno anche l'applicazione di queste vescicole extracellulari come biomarcatori diagnostici. Il nostro laboratorio si concentrerà sulla produzione affidabile di vescicole extracellulari interstiziali del muscolo scheletrico ad alta purezza e ad alto rendimento in modo efficiente ed efficace in termini di tempo. Ci proponiamo di esplorare il loro ruolo patologico e il loro potenziale terapeutico, in particolare nel contesto delle malattie neuromuscolari.
Per iniziare, fissare la zampa del topo soppressa in una piastra sterile con il lato anteriore della zampa rivolto verso l'alto. Usando le forbici da dissezione, praticare una piccola incisione di cinque millimetri nella pelle sul lato laterale della caviglia del topo. Inserisci una lama delle forbici nell'incisione, posizionandola sotto la pelle, ma sopra il tessuto muscolare.
Quindi, tagliare la pelle verso l'alto verso il ginocchio per estendere l'incisione. Usa una pinzetta ruvida per afferrare la pelle lungo l'incisione e tirarla indietro per allargare l'apertura, finché il muscolo non diventa visibile. Ora, individua il muscolo tibiale anteriore, o TA, che va dal ginocchio alla caviglia, lungo il lato laterale dell'osso tibia.
Usa una pinzetta affilata per afferrare e staccare con cura il tessuto connettivo che copre il muscolo TA. Vicino alla caviglia, identificare il tendine TA collegato al muscolo TA e il tendine EDL più piccolo, situato accanto al tendine TA sul lato laterale. Usa le forbici da dissezione per recidere entrambi i tendini.
Usa una pinzetta ruvida per afferrare entrambi i tendini. Con un altro paio di pinzette, separare accuratamente i tendini, isolando il TA dall'EDL. Quindi, solleva il muscolo TA dal tendine appena reciso usando una pinzetta ruvida.
Usa le forbici da dissezione per tagliare il tendine TA vicino al ginocchio, rimuovendo il muscolo. Ora, rilascia la gamba e capovolgi il mouse in modo che il lato posteriore della gamba sia rivolto verso l'alto. Con parte della pelle già rimossa, utilizzare le forbici da dissezione per tagliare la pelle rimanente vicino alla caviglia.
Afferra la pelle tagliata con una pinzetta ruvida e sbucciala verso l'alto verso la parte posteriore del ginocchio, esponendo il muscolo gastrocnemio. Usa le forbici da dissezione per recidere il tendine del gastrocnemio vicino alla caviglia. Afferra il tendine del gastrocnemio con una pinzetta ruvida e sollevalo verso l'alto per esporre la parte inferiore del muscolo gastrocnemio.
Quindi, individua il tendine soleo più piccolo sotto il gastrocnemio, vicino al ginocchio, dove il gastrocnemio è ancora collegato. Usa le forbici da dissezione per recidere il tendine soleo, permettendo al muscolo soleo di contrarsi verso l'alto. Afferra il tendine soleo reciso con una pinzetta affilata e sollevalo delicatamente per staccare il muscolo soleo dalla parte inferiore del gastrocnemio.
Usa le forbici da dissezione per recidere l'estremità del soleo, dove si attacca all'estremità recisa del gastrocnemio, separando completamente i due muscoli. Usando le forbici da dissezione, taglia l'estremità del gastrocnemio vicino al ginocchio e posizionalo in PBS su ghiaccio. Dopo aver rimosso i quattro muscoli sotto il ginocchio, capovolgi il mouse in modo che il lato anteriore sia rivolto verso l'alto.
Posizionare la gamba del mouse con un angolo di 90 gradi per costringere il muscolo quadricipite a flettersi. Usa le forbici da dissezione per recidere il tendine più vicino al ginocchio. Quindi, per separare il quadricipite dal femore, tagliare tra il muscolo e l'osso fino a quando rimane attaccato solo il tendine prossimale.
Recidere il tendine prossimale usando le forbici da dissezione e rimuovere i quadricipiti. Sciacquare più volte tutti i muscoli rimossi con PBS per rimuovere contaminanti come pelo e sangue. Asciugare delicatamente i muscoli con carta assorbente.
Inizia rimuovendo delicatamente i tendini dal campione muscolare usando una pinzetta affilata, una pinzetta per schegge, bisturi o forbici. Quindi, usando le forbici o un bisturi, taglia il muscolo longitudinalmente lungo le fibre muscolari da un tendine all'altro, in pezzi spessi un millimetro. Per preparare il tampone degli enzimi digestivi, mescolare due milligrammi di collagenasi, due enzimi per millilitro di DMEM con una soluzione di penicillina streptomicina all'1%.
Dopo la miscelazione, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri. Separare il tessuto muscolare in aliquote, ciascuna contenente 20 milligrammi di muscolo. Aggiungere un millilitro del tampone preparato a ciascuna aliquota per la dissociazione enzimatica e incubare.
Prepara ed etichetta le nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Impostare un filtro da 0,45 micrometri rimuovendo lo stantuffo da una siringa da cinque millilitri. Avvitare il mozzo della siringa nell'estremità superiore del filtro da 0,45 micrometri e posizionare l'estremità inferiore del filtro in una provetta da microcentrifuga etichettata.
Quindi, centrifugare la miscela per 10 minuti a 1000 G e quattro gradi Celsius fino a ottenere detriti di pellet. Utilizzare una micropipetta P-200 per trasferire il surnatante nella siringa. Dopo aver reinserito lo stantuffo nella siringa, spingere lentamente il surnatante attraverso il filtro, lasciandolo raccogliere nella provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettata.
Rimuovere nuovamente lo stantuffo della siringa. Utilizzando una micropipetta P-200, aggiungere circa 200 microlitri di PBS nella siringa. Reinserire lo stantuffo e spingere lentamente i 200 microlitri di PBS attraverso il filtro per eliminare l'eventuale surnatante rimanente nella provetta per microcentrifuga etichettata.
Trasferire la soluzione filtrata in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri, adatte per velocità fino a 200.000 G.Dopo aver chiuso le provette, posizionarle nel rotore della microultracentrifuga per assicurarsi che siano bilanciate. Accendi la micro ultracentrifuga e impostala in modo che funzioni per un'ora a 100.000 g e quattro gradi Celsius. Posizionare il rotore carico con le provette all'interno della microultracentrifuga.
Chiudere il coperchio e accendere l'aspirapolvere per avviare il processo. Una volta che il vuoto raggiunge il livello due, premere il pulsante di avvio e attendere il completamento del processo di centrifugazione. Al termine del ciclo di centrifugazione, fare clic sul pulsante del vuoto per ripressurizzare la camera prima di rimuovere il rotore e le provette.
Rimuovere con cautela il surnatante da ciascuna provetta utilizzando una micropipetta P-200. Quindi, utilizzare la stessa micropipetta P-200 per aggiungere 50 microlitri di PBS a ciascuna provetta.
