Этот протокол направлен на изоляцию и очищение межклеточных пузырьков скелетных мышц в мышечных тканях грызунов. Эта внеклеточная везикула предоставит бесценную информацию о механизме заболевания мышечного статуса человека с потенциальным применением в качестве диагностических биомаркеров и терапевтических средств. Этот стандартизированный протокол позволит анализировать и сравнивать характеристики EV, полученных из скелетных мышц, в различных образцах мышц, включая выход, размер, состав груза и функцию.
Эти результаты углубят наше понимание их роли в различных физиологических и патологических процессах, а также облегчат применение этих ВВ в качестве диагностических биомаркеров. Наша лаборатория сосредоточится на надежном производстве межклеточных везикул скелетных мышц высокой чистоты и высокой производительности эффективным и экономичным по времени способом. Мы стремимся изучить их патологическую роль и терапевтический потенциал, особенно в контексте нервно-мышечных расстройств.
Для начала закрепите усыпленную мышиную ножку в стерильной пластине передней стороной ноги вверх. С помощью ножниц для рассечения сделайте небольшой разрез в пять миллиметров на коже с боковой стороны лодыжки мыши. Вставьте одно лезвие ножниц в разрез, расположив его под кожей, но над мышечной тканью.
Затем разрежьте кожу вверх по направлению к колену, чтобы расширить разрез. Используйте пинцет с шероховатым концом, чтобы захватить кожу вдоль разреза, и потяните ее назад, чтобы расширить отверстие, пока мышца не станет видимой. Теперь найдите переднюю большеберцовую мышцу, или мышцу ТА, идущую от колена к лодыжке, вдоль боковой стороны большеберцовой кости.
С помощью заостренного пинцета захватите и осторожно снимите соединительную ткань, покрывающую мышцу ТА. Рядом с лодыжкой определите сухожилие ТА, соединенное с мышцей ТА, и меньшее сухожилие EDL, расположенное рядом с сухожилием ТА на боковой стороне. С помощью ножниц для рассечения разрежьте оба сухожилия.
Используйте пинцет с шероховатым концом, чтобы захватить оба сухожилия. Еще одной парой пинцетов осторожно отделите сухожилия, изолировав ТА от ЖВЛП. Затем подтяните мышцу ТА за только что разорванное сухожилие с помощью пинцета с шероховатым концом.
С помощью ножниц для рассечения сухожилия ТА в районе колена, удаляя мышцу. Теперь отпустите ногу и переверните мышь так, чтобы задняя сторона ноги была обращена вверх. Когда часть кожи уже удалена, используйте ножницы для вскрытия, чтобы разрезать оставшуюся кожу возле лодыжки.
Возьмите срезанную кожу пинцетом с шероховатым концом и отклейте ее вверх к задней части колена, обнажая икроножную мышцу. С помощью ножниц для вскрытия разрежьте сухожилие икроножной мышцы возле лодыжки. Обхватите сухожилие икроножной мышцы пинцетом с шероховатым концом и поднимите его вверх, чтобы обнажить нижнюю часть икроножной мышцы.
Затем найдите меньшее сухожилие камбаловидной мышцы под икроножной мышцей, ближе к колену, где икроножная мышца все еще соединена. Используйте ножницы для рассечения, чтобы разорвать камбаловидное сухожилие, позволяя камбаловидной мышце сокращаться вверх. Возьмитесь за разорванное сухожилие камбаловидной мышцы пинцетом с острым концом и осторожно поднимите его, чтобы отделить камбаловидную мышцу от нижней части икроножной мышцы.
С помощью ножниц для рассечения отрежьте конец камбаловидной мышцы, где он прикрепляется к отрезанному концу икроножной мышцы, полностью разделяя две мышцы. С помощью ножниц для препарирования разрежьте конец икроножной мышцы возле колена и поместите его в ПБС на лед. После удаления четырех мышц ниже колена переверните мышь так, чтобы передняя сторона была обращена вверх.
Расположите ножку мыши под углом 90 градусов, чтобы заставить четырехглавую мышцу напрячься. С помощью ножниц для вскрытия разрежьте сухожилие, ближайшее к колену. Затем, чтобы отделить четырехглавую мышцу от бедренной кости, разрежьте между мышцей и костью до тех пор, пока не останется только проксимальное сухожилие.
Разрежьте проксимальное сухожилие с помощью ножниц для рассечения и удалите квадрицепсы. Промойте все удаленные мышцы несколько раз с помощью PBS, чтобы удалить загрязнения, такие как шерсть и кровь. Аккуратно высушите мышцы с помощью бумажных полотенец.
Начните с аккуратного удаления сухожилий из мышечного образца с помощью пинцета с острым концом, пинцета-осколка, скальпеля или ножниц. Затем с помощью ножниц или скальпеля разрежьте мышцу продольно вдоль мышечных волокон от одного сухожилия до другого, на куски толщиной в один миллиметр. Чтобы приготовить буфер из пищеварительных ферментов, смешайте два миллиграмма коллагеназы, два фермента на миллилитр DMEM с 1% раствором пенициллина стрептомицина.
После смешивания отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 микрометра. Разделите мышечную ткань на аликвоты, каждая из которых содержит 20 миллиграммов мышцы. Добавьте в каждую аликвоту по одному миллилитру приготовленного буфера для ферментативной диссоциации и инкубируйте.
Подготовьте и промаркируйте новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. Установите фильтр 0,45 микрометра, сняв поршень с пятимиллилитрового шприца. Вкрутите ступицу шприца в верхний конец фильтра 0,45 микрометра и поместите нижний конец фильтра в пробирку для микроцентрифуги с маркировкой.
Затем центрифугируйте смесь в течение 10 минут при температуре 1000 G и четырех градусах Цельсия для удаления мусора из гранул. С помощью микропипетки Р-200 перенесите надосадочную жидкость в шприц. После повторного введения поршня в шприц медленно протолкните надосадочную жидкость через фильтр, позволяя ей собраться в маркированной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитров.
Снова снимите поршень шприца. С помощью микропипетки Р-200 добавьте в шприц примерно 200 микролитров PBS. Снова вставьте поршень и медленно пропустите 200 микролитров PBS через фильтр, чтобы смыть оставшуюся надосадочную жидкость в пробирку микроцентрифуги с маркировкой.
Перелейте отфильтрованный раствор в новые 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, подходящие для скоростей до 200 000 G. После закрытия пробирок поместите их в ротор микроультрацентрифуги, чтобы убедиться, что они сбалансированы. Включите микроцентрифугу и настройте ее на работу в течение часа при температуре 100 000 G и четырех градусах Цельсия. Поместите загруженный ротор с пробирками внутрь микроцентрифуги.
Закройте крышку и включите пылесос, чтобы начать процесс. Как только вакуум достигнет второго уровня, нажмите кнопку запуска и дождитесь завершения процесса центрифугирования. После завершения цикла центрифугирования нажмите кнопку вакуума, чтобы восстановить давление в камере, прежде чем снимать ротор и трубки.
Осторожно удалите надосадочную жидкость из каждой пробирки с помощью микропипетки Р-200. Затем с помощью той же микропипетки P-200 добавьте 50 микролитров PBS в каждую пробирку.
