Este protocolo tiene como objetivo aislar y purificar las vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético en tejidos musculares de roedores. Esta vesícula extracelular proporcionará información invaluable sobre el mecanismo de la enfermedad del estado muscular humano con potencial aplicación como biomarcadores de diagnóstico y vehículos terapéuticos. Este protocolo estandarizado permitirá el análisis y la comparación de las características del EV derivado del músculo esquelético en diferentes muestras de músculo, incluido el rendimiento, el tamaño, la composición de la carga y la función.
Estos resultados permitirán avanzar en la comprensión de su papel en diversos procesos fisiológicos y patológicos, y también facilitarán la aplicación de estos VE como biomarcadores de diagnóstico. Nuestro laboratorio se centrará en producir de manera confiable vesículas extracelulares intersticiales de músculo esquelético de alta pureza y alto rendimiento de una manera eficiente y efectiva en el tiempo. Nuestro objetivo es explorar su papel patológico y su potencial terapéutico, particularmente en el contexto de los trastornos neuromusculares.
Para comenzar, asegure la pata de ratón sacrificada en una placa estéril con el lado anterior de la pata hacia arriba. Con unas tijeras de disección, haga una pequeña incisión de cinco milímetros en la piel en el lado lateral del tobillo del ratón. Inserte una hoja de las tijeras en la incisión, colocándola debajo de la piel, pero por encima del tejido muscular.
Luego, corte la piel hacia arriba, hacia la rodilla, para extender la incisión. Use pinzas de punta áspera para agarrar la piel a lo largo de la incisión y tirar de ella hacia atrás para ensanchar la abertura, hasta que el músculo se vuelva visible. Ahora, localiza el tibial anterior, o músculo TA, que va desde la rodilla hasta el tobillo, a lo largo del lado lateral del hueso de la tibia.
Use pinzas afiladas para agarrar y despegar con cuidado el tejido conectivo que cubre el músculo TA. Cerca del tobillo, identifique el tendón TA conectado al músculo TA y el tendón EDL más pequeño, ubicado junto al tendón TA en el lado lateral. Usa tijeras de disección para cortar ambos tendones.
Use pinzas de punta áspera para agarrar ambos tendones. Con otro par de pinzas, separe cuidadosamente los tendones, aislando el TA del EDL. Luego, levante el músculo TA por el tendón recién cortado con pinzas de punta áspera.
Use tijeras de disección para cortar el tendón TA cerca de la rodilla, extirpando el músculo. Ahora, suelta la pierna y voltea el ratón de modo que la parte posterior de la pata mire hacia arriba. Con parte de la piel ya retirada, use unas tijeras de disección para cortar la piel restante cerca del tobillo.
Agarra la piel cortada con unas pinzas ásperas y pélala hacia arriba, hacia la parte posterior de la rodilla, dejando al descubierto el músculo gastrocnemio. Use tijeras de disección para cortar el tendón gastrocnemio cerca del tobillo. Sujeta el tendón gastrocnemio con unas pinzas ásperas y levántalo hacia arriba para exponer la parte inferior del músculo gastrocnemio.
Luego, ubica el tendón sóleo más pequeño debajo del gastrocnemio, cerca de la rodilla, donde el gastrocnemio aún está conectado. Use tijeras de disección para cortar el tendón sóleo, permitiendo que el músculo sóleo se contraiga hacia arriba. Agarre el tendón del sóleo cortado con pinzas afiladas y levántelo suavemente para separar el músculo sóleo de la parte inferior del gastrocnemio.
Use tijeras de disección para cortar el extremo del sóleo, donde se une al extremo cortado del gastrocnemio, separando completamente los dos músculos. Con unas tijeras de disección, corte el extremo del gastrocnemio cerca de la rodilla y colóquelo en PBS sobre hielo. Después de quitar los cuatro músculos debajo de la rodilla, voltee el mouse para que la parte anterior mire hacia arriba.
Coloque la pierna del ratón en un ángulo de 90 grados para forzar la flexión del músculo cuádriceps. Use tijeras de disección para cortar el tendón más cercano a la rodilla. Luego, para separar los cuádriceps del fémur, corte entre el músculo y el hueso hasta que solo quede unido el tendón proximal.
Corta el tendón proximal con unas tijeras de disección y retira los cuádriceps. Enjuague todos los músculos extirpados varias veces con PBS para eliminar contaminantes como el pelo y la sangre. Seca suavemente los músculos con toallas de papel.
Comience retirando suavemente los tendones de la muestra de músculo con pinzas afiladas, pinzas de astillas, bisturíes o tijeras. Luego, con unas tijeras o un bisturí, corte el músculo longitudinalmente a lo largo de las fibras musculares de un tendón al otro, en trozos de un milímetro de grosor. Para preparar el tampón de enzimas digestivas, mezcle dos miligramos de colagenasa, dos enzimas por mililitro de DMEM con una solución de estreptomicina de penicilina al 1%.
Después de mezclar, filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Separe el tejido muscular en alícuotas, cada una de las cuales contiene 20 miligramos de músculo. Añadir un mililitro del tampón preparado a cada alícuota para la disociación enzimática e incubar.
Prepare y etiquete los nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Instale un filtro de 0,45 micrómetros quitando el émbolo de una jeringa de cinco mililitros. Atornille el cubo de la jeringa en el extremo superior del filtro de 0,45 micrómetros y coloque el extremo inferior del filtro en un tubo de microcentrífuga etiquetado.
Luego, centrifugar la mezcla durante 10 minutos a 1000 g y cuatro grados centígrados hasta los residuos de pellets. Utilice una micropipeta P-200 para transferir el sobrenadante a la jeringa. Después de volver a insertar el émbolo en la jeringa, empuje lentamente el sobrenadante a través del filtro, permitiendo que se acumule en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros etiquetado.
Vuelva a retirar el émbolo de la jeringa. Con una micropipeta P-200, añada aproximadamente 200 microlitros de PBS en la jeringa. Vuelva a insertar el émbolo y empuje lentamente los 200 microlitros de PBS a través del filtro para enjuagar cualquier sobrenadante restante en el tubo de microcentrífuga etiquetado.
Transfiera la solución filtrada a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, adecuados para velocidades de hasta 200.000 G. Después de cerrar los tubos, colóquelos en el rotor de la microcentrífuga para asegurarse de que estén equilibrados. Encienda la microcentrífuga y configúrela para que funcione durante una hora a 100.000 g y cuatro grados centígrados. Coloque el rotor cargado con los tubos dentro de la micro ultracentrífuga.
Cierre la tapa y encienda la aspiradora para iniciar el proceso. Una vez que el vacío alcance el nivel dos, presione el botón de inicio y espere a que se complete el proceso de centrifugación. Una vez completado el ciclo de centrifugación, haga clic en el botón de vacío para volver a presurizar la cámara antes de retirar el rotor y los tubos.
Retire con cuidado el sobrenadante de cada tubo con una micropipeta P-200. A continuación, utilice la misma micropipeta P-200 para añadir 50 microlitros de PBS a cada tubo.
