Ce protocole vise à isoler et à purifier les vésicules extracellulaires interstitielles des muscles squelettiques dans les tissus musculaires des rongeurs. Cette vésicule extracellulaire fournira des informations inestimables sur le mécanisme de la maladie de l’état humain musculaire, avec une application potentielle en tant que biomarqueurs diagnostiques et véhicules thérapeutiques. Ce protocole standardisé permettra d’analyser et de comparer les caractéristiques de l’EV dérivée du muscle squelette dans différents échantillons musculaires, y compris le rendement, la taille, la composition de la cargaison et la fonction.
Ces résultats nous permettront de mieux comprendre leurs rôles dans divers processus physiologiques et pathologiques, et faciliteront également l’application de ces VE en tant que biomarqueurs diagnostiques. Notre laboratoire se concentrera sur la production fiable de vésicules extracellulaires interstitielles musculaires squelettiques de haute pureté et à haut rendement, de manière efficace et rapide. Notre objectif est d’explorer leur rôle pathologique et leur potentiel thérapeutique, en particulier dans le contexte des troubles neuromusculaires.
Pour commencer, fixez la patte de la souris euthanasiée dans une plaque stérile avec la face antérieure de la patte vers le haut. À l’aide de ciseaux de dissection, faites une petite incision de cinq millimètres dans la peau du côté latéral de la cheville de la souris. Insérez une lame des ciseaux dans l’incision, en la positionnant sous la peau, mais au-dessus du tissu musculaire.
Ensuite, coupez la peau vers le haut vers le genou pour prolonger l’incision. À l’aide d’une pince à épiler à bout grossier, saisissez la peau le long de l’incision et tirez-la vers l’arrière pour élargir l’ouverture, jusqu’à ce que le muscle devienne visible. Maintenant, localisez le muscle tibial antérieur, ou muscle TA, allant du genou à la cheville, le long du côté latéral de l’os du tibia.
Utilisez une pince à épiler aiguisée pour saisir et décoller soigneusement le tissu conjonctif recouvrant le muscle TA. Près de la cheville, identifiez le tendon TA relié au muscle TA et le plus petit tendon EDL, situé à côté du tendon TA sur le côté latéral. Utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner les deux tendons.
Utilisez une pince à épiler à bout grossier pour saisir les deux tendons. Avec une autre pince à épiler, séparez soigneusement les tendons, en isolant le TA de l’EDL. Ensuite, soulevez le muscle TA par le tendon fraîchement sectionné à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux.
Utilisez des ciseaux de dissection pour couper le tendon TA près du genou, en retirant le muscle. Maintenant, relâchez la jambe et retournez la souris de sorte que le côté postérieur de la jambe soit tourné vers le haut. Une partie de la peau déjà enlevée à l’aide de ciseaux de dissection pour couper la peau restante près de la cheville.
Saisissez la peau coupée à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux et pelez-la vers le haut vers l’arrière du genou, exposant le muscle gastrocnémien. Utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner le tendon gastrocnémien près de la cheville. Saisissez le tendon gastrocnémien à l’aide d’une pince à épiler à bout rugueux et soulevez-le vers le haut pour exposer la face inférieure du muscle gastrocnémien.
Ensuite, localisez le plus petit tendon soléaire sous le gastrocnémien, près du genou, où le gastrocnémien est toujours connecté. Utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner le tendon soléaire, permettant au muscle soléaire de se contracter vers le haut. Saisissez le tendon soléaire sectionné à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu et soulevez-le doucement pour détacher le muscle soléaire de la face inférieure du gastrocnémien.
Utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner l’extrémité du soléaire, où il s’attache à l’extrémité sectionnée du gastrocnémien, séparant complètement les deux muscles. À l’aide de ciseaux de dissection, coupez l’extrémité du gastrocnémien près du genou et placez-le dans du PBS sur de la glace. Après avoir retiré les quatre muscles sous le genou, retournez la souris de manière à ce que la face antérieure soit tournée vers le haut.
Positionnez la patte de la souris à un angle de 90 degrés pour forcer le muscle quadriceps à fléchir. Utilisez des ciseaux de dissection pour sectionner le tendon le plus proche du genou. Ensuite, pour séparer le quadriceps du fémur, coupez entre le muscle et l’os jusqu’à ce que seul le tendon proximal reste attaché.
Sectionnez le tendon proximal à l’aide de ciseaux de dissection et retirez les quadriceps. Rincez tous les muscles enlevés plusieurs fois avec du PBS pour éliminer les contaminants tels que la fourrure et le sang. Séchez doucement les muscles à l’aide d’essuie-tout.
Commencez par retirer délicatement les tendons de l’échantillon musculaire à l’aide d’une pince à épiler à bout pointu, d’une pince à échardes, d’un scalpel ou de ciseaux. Ensuite, à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel, coupez le muscle longitudinalement le long des fibres musculaires d’un tendon à l’autre, en morceaux d’un millimètre d’épaisseur. Pour préparer un tampon d’enzymes digestives, mélangez deux milligrammes de collagénase, deux enzymes par millilitre de DMEM avec une solution de streptomycine à 1 % de pénicilline.
Après le mélange, filtrez la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre. Séparez le tissu musculaire en aliquotes, chacune contenant 20 milligrammes de muscle. Ajouter un millilitre du tampon préparé à chaque aliquote pour la dissociation enzymatique et incuber.
Préparez et étiquetez les nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Installez un filtre de 0,45 micromètre en retirant le piston d’une seringue de cinq millilitres. Vissez le moyeu de la seringue dans l’extrémité supérieure du filtre de 0,45 micromètre et positionnez l’extrémité inférieure du filtre dans un tube de microcentrifugation étiqueté.
Ensuite, centrifugez le mélange pendant 10 minutes à 1000 G et quatre degrés Celsius pour obtenir des débris de granulés. À l’aide d’une micropipette P-200, transférez le surnageant dans la seringue. Après avoir réinséré le piston dans la seringue, poussez lentement le surnageant à travers le filtre, en lui permettant de s’accumuler dans le tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre étiqueté.
Retirez à nouveau le piston de la seringue. À l’aide d’une micropipette P-200, ajoutez environ 200 microlitres de PBS dans la seringue. Réinsérez le piston et poussez lentement les 200 microlitres de PBS à travers le filtre pour rincer tout surnageant restant dans le tube de microcentrifugation étiqueté.
Transférez la solution filtrée dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre, adaptés à des vitesses allant jusqu’à 200 000 G.Après avoir fermé les tubes, placez-les dans le rotor de la micro-ultracentrifugeuse pour vous assurer qu’ils sont équilibrés. Allumez la micro-ultracentrifugeuse et réglez-la pour qu’elle fonctionne pendant une heure à 100 000 G et quatre degrés Celsius. Placez le rotor chargé avec les tubes à l’intérieur de la micro-ultracentrifugeuse.
Fermez le couvercle et allumez l’aspirateur pour lancer le processus. Une fois que le vide atteint le niveau deux, appuyez sur le bouton de démarrage et attendez la fin du processus de centrifugation. Une fois le cycle de centrifugation terminé, cliquez sur le bouton de vide pour repressuriser la chambre avant de retirer le rotor et les tubes.
Retirez délicatement le surnageant de chaque tube à l’aide d’une micropipette P-200. Ensuite, utilisez la même micropipette P-200 pour ajouter 50 microlitres de PBS dans chaque tube.
