该方案旨在分离和纯化啮齿动物肌肉组织中的骨骼肌间质细胞外囊泡。这种细胞外囊泡将为肌肉人体状态疾病机制提供宝贵的见解，并可能用作诊断生物标志物和治疗载体。该标准化协议将能够分析和比较不同肌肉样本中骨骼肌衍生的 EV 的特征，包括产量、大小、货物组成和功能。
这些结果将促进我们对它们在各种生理和病理过程中的作用的理解，也将促进这些 EV 作为诊断生物标志物的应用。我们的实验室将专注于以高效和时效的方式可靠地生产高纯度和高产量的骨骼肌间质细胞外囊泡。我们旨在探索它们的病理作用和治疗潜力，特别是在神经肌肉疾病的背景下。
首先，将安乐死的小鼠腿固定在无菌板中，腿的前侧朝上。使用解剖剪刀，在小鼠脚踝外侧的皮肤上做一个 5 毫米的小切口。将剪刀的一把刀片插入切口，将其定位在皮肤下方，但在肌肉组织上方。
然后，将皮肤向上切向膝盖以延长切口。使用粗头镊子沿切口抓住皮肤并将其向后拉以扩大开口，直到肌肉变得可见。现在，沿着胫骨的外侧找到从膝盖到脚踝的胫骨前肌或 TA 肌。
使用锋利的镊子抓住并小心地剥下覆盖 TA 肌肉的结缔组织。在脚踝附近，识别连接到 TA 肌的 TA 肌腱和较小的 EDL 肌腱，位于外侧 TA 肌腱旁边。使用解剖剪刀切断两条肌腱。
使用粗头镊子抓住两条肌腱。用另一对镊子小心地分离肌腱，将 TA 与 EDL 隔离开来。然后，使用粗头镊子通过新切断的肌腱提起 TA 肌肉。
使用解剖剪刀剪断膝盖附近的 TA 肌腱，去除肌肉。现在，松开腿并翻转鼠标，使腿的后侧朝上。去除部分皮肤后，使用解剖剪刀剪掉脚踝附近的剩余皮肤。
用粗头镊子抓住切开的皮肤，向膝盖后部向上剥开，露出腓肠肌。使用解剖剪刀切断踝关节附近的腓肠肌腱。用粗头镊子抓住腓肠肌肌腱，然后向上抬起，露出腓肠肌的下侧。
然后，找到腓肠肌下方较小的比目鱼肌肌腱，靠近膝盖，腓肠肌仍然连接在那里。使用解剖剪刀切断比目鱼肌肌腱，让比目鱼肌向上收缩。用锋利的镊子抓住切断的比目鱼肌肌腱，轻轻抬起，使比目鱼肌从腓肠肌下侧分离。
使用解剖剪刀切断比目鱼肌的末端，在那里它附着在腓肠肌的切断端，将两块肌肉完全分开。使用解剖剪刀，剪下膝盖附近的腓肠肌末端，并将其放入冰上的 PBS 中。去除膝盖以下的四块肌肉后，翻转鼠标，使前侧朝上。
将鼠标腿呈 90 度角放置，以迫使股四头肌弯曲。使用解剖剪刀切断最靠近膝盖的肌腱。然后，为了将股四头肌与股骨分开，在肌肉和骨骼之间切开，直到只连接近端肌腱。
用解剖剪刀切断近端肌腱，并切除股四头肌。用 PBS 冲洗所有去除的肌肉数次，以去除皮毛和血液等污染物。用纸巾轻轻擦干肌肉。
首先使用锋利的镊子、碎镊、手术刀或剪刀轻轻地从肌肉样本中去除肌腱。然后，使用剪刀或手术刀，沿着肌纤维从一根肌腱纵向切成另一根肌腱，切成一毫米厚的块。为了制备消化酶缓冲液，将 2 毫克胶原酶、每毫升 DMEM 2 酶与 1% 青霉素链霉素溶液混合。
混合后，通过 0.2 微米过滤器过滤溶液。将肌肉组织分成等分试样，每分试样含有 20 毫克肌肉。向每个等分试样中加入 1 毫升制备的缓冲液进行酶解离并孵育。
准备并标记新的 1.5 ml 微量离心管。从 5 毫升注射器中取出柱塞，设置一个 0.45 微米的过滤器。将注射器针座拧入 0.45 微米过滤器的顶端，并将过滤器的底端放入贴有标签的微量离心管中。
然后，将混合物在 1000 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，以沉淀碎片。使用 P-200 微量移液器将上清液转移到注射器中。将柱塞重新插入注射器后，缓慢地将上清液推入过滤器，使其聚集在贴有标签的 1.5 mL 微量离心管中。
再次取下注射器柱塞。使用 P-200 微量移液器，向注射器中加入大约 200 微升 PBS。重新插入柱塞，缓慢将 200 μL PBS 推入过滤器，将剩余的上清液冲洗到标记的微量离心管中。
将过滤后的溶液转移到新的 1.5 毫升微量离心管中，适用于高达 200， 000 G 的速度。关闭试管后，将它们放入微量超速离心机的转子中，以确保它们平衡。打开微量超速离心机，将其设置为在 100， 000 G 和 4 摄氏度下运行 1 小时。将装有管子的转子放入微量超速离心机中。
盖上盖子并打开真空以启动该过程。一旦真空度达到 2 级，按下开始按钮并等待离心过程完成。离心循环完成后，单击真空按钮对腔室重新加压，然后再取出转子和离心管。
使用 P-200 微量移液器小心地从每个试管中取出上清液。然后，使用相同的 P-200 微量移液器向每个试管中加入 50 微升 PBS。
