Este protocolo visa isolar e purificar vesículas extracelulares intersticiais do músculo esquelético em tecidos musculares de roedores. Esta vesícula extracelular fornecerá informações valiosas sobre o mecanismo da doença do estado humano muscular com potencial aplicação como biomarcadores diagnósticos e veículos terapêuticos. Este protocolo padronizado permitirá a análise e a comparação das características do EV derivado do músculo esquelético em diferentes amostras musculares, incluindo o rendimento, tamanho, composição e função da carga.
Esses resultados avançarão nossa compreensão de seus papéis em vários processos fisiológicos e patológicos e também facilitarão a aplicação desses EVs como biomarcadores diagnósticos. Nosso laboratório se concentrará na produção confiável de vesículas extracelulares do músculo esquelético de alta pureza e alto rendimento de maneira eficiente e eficaz em termos de tempo. Nosso objetivo é explorar seu papel patológico e potencial terapêutico, particularmente no contexto de distúrbios neuromusculares.
Para começar, prenda a perna do camundongo sacrificada em uma placa estéril com o lado anterior da perna voltado para cima. Usando uma tesoura de dissecação, faça uma pequena incisão de cinco milímetros na pele na parte lateral do tornozelo do camundongo. Insira uma lâmina da tesoura na incisão, posicionando-a sob a pele, mas acima do tecido muscular.
Em seguida, corte a pele para cima em direção ao joelho para estender a incisão. Use uma pinça áspera para agarrar a pele ao longo da incisão e puxe-a para trás para alargar a abertura, até que o músculo se torne visível. Agora, localize o músculo tibial anterior, ou TA, que vai do joelho ao tornozelo, ao longo do lado lateral do osso da tíbia.
Use uma pinça afiada para agarrar e retirar cuidadosamente o tecido conjuntivo que cobre o músculo TA. Próximo ao tornozelo, identifique o tendão TA conectado ao músculo TA e o tendão EDL menor, localizado próximo ao tendão TA na face lateral. Use uma tesoura de dissecção para cortar os dois tendões.
Use uma pinça áspera para agarrar os dois tendões. Com outra pinça, separe cuidadosamente os tendões, isolando o TA do EDL. Em seguida, levante o músculo TA pelo tendão recém-cortado usando uma pinça áspera.
Use uma tesoura de dissecção para cortar o tendão TA próximo ao joelho, removendo o músculo. Agora, solte a perna e vire o mouse para que a parte posterior da perna fique voltada para cima. Com parte da pele já removida, use uma tesoura de dissecção para cortar a pele restante perto do tornozelo.
Pegue a pele cortada com uma pinça áspera e descasque-a para cima em direção à parte de trás do joelho, expondo o músculo gastrocnêmio. Use uma tesoura de dissecção para cortar o tendão gastrocnêmio próximo ao tornozelo. Segure o tendão gastrocnêmio com uma pinça áspera e levante-o para expor a parte inferior do músculo gastrocnêmio.
Em seguida, localize o tendão sóleo menor abaixo do gastrocnêmio, próximo ao joelho, onde o gastrocnêmio ainda está conectado. Use uma tesoura de dissecção para cortar o tendão do sóleo, permitindo que o músculo sóleo se contraia para cima. Segure o tendão sóleo cortado com uma pinça afiada e levante-o suavemente para separar o músculo sóleo da parte inferior do gastrocnêmio.
Use uma tesoura de dissecção para cortar a extremidade do sóleo, onde ela se liga à extremidade cortada do gastrocnêmio, separando totalmente os dois músculos. Usando uma tesoura de dissecação, corte a extremidade do gastrocnêmio perto do joelho e coloque-o em PBS no gelo. Depois de remover os quatro músculos abaixo do joelho, vire o mouse para que o lado anterior fique voltado para cima.
Posicione a perna do mouse em um ângulo de 90 graus para forçar o músculo quadríceps a flexionar. Use uma tesoura de dissecção para cortar o tendão mais próximo do joelho. Em seguida, para separar o quadríceps do fêmur, corte entre o músculo e o osso até que apenas o tendão proximal permaneça preso.
Corte o tendão proximal usando uma tesoura de dissecção e remova o quadríceps. Enxágue todos os músculos removidos várias vezes com PBS para remover contaminantes como pêlo e sangue. Seque suavemente os músculos usando toalhas de papel.
Comece removendo suavemente os tendões da amostra muscular usando pinças afiadas, pinças de lascas, bisturis ou tesouras. Em seguida, usando uma tesoura ou um bisturi, corte o músculo longitudinalmente ao longo das fibras musculares de um tendão ao outro, em pedaços de um milímetro de espessura. Para preparar o tampão da enzima digestiva, misture dois miligramas de colagenase, duas enzimas por mililitro de DMEM com solução de estreptomicina de penicilina a 1%.
Após a mistura, filtrar a solução através de um filtro de 0,2 micrómetros. Separe o tecido muscular em alíquotas, cada uma contendo 20 miligramas de músculo. Adicionar um mililitro do tampão preparado a cada alíquota para a dissociação enzimática e incubar.
Prepare e rotule novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Configure um filtro de 0,45 micrômetro removendo o êmbolo de uma seringa de cinco mililitros. Aparafuse o cubo da seringa na extremidade superior do filtro de 0.45 micrômetro e posicione a extremidade inferior do filtro em um tubo de microcentrífuga rotulado.
Em seguida, centrifugue a mistura por 10 minutos a 1000 G e quatro graus Celsius para pellet detritos. Use uma micropipeta P-200 para transferir o sobrenadante para a seringa. Depois de reinserir o êmbolo na seringa, empurre lentamente o sobrenadante através do filtro, permitindo que ele se acumule no tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado.
Remova o êmbolo da seringa novamente. Usando uma micropipeta P-200, adicione aproximadamente 200 microlitros de PBS na seringa. Reinsira o êmbolo e empurre lentamente os 200 microlitros de PBS através do filtro para liberar qualquer sobrenadante restante no tubo de microcentrífuga rotulado.
Transfira a solução filtrada para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, adequados para velocidades de até 200.000 G. Depois de fechar os tubos, coloque-os no rotor da microcentrífuga para garantir que estejam equilibrados. Ligue a micro ultracentrífuga e configure-a para funcionar por uma hora a 100.000 G e quatro graus Celsius. Coloque o rotor carregado com os tubos dentro da micro ultracentrífuga.
Feche a tampa e ligue o aspirador para iniciar o processo. Quando o vácuo atingir o nível dois, pressione o botão Iniciar e aguarde a conclusão do processo de centrifugação. Após a conclusão do ciclo de centrifugação, clique no botão de vácuo para repressurizar a câmara antes de remover o rotor e os tubos.
Remova cuidadosamente o sobrenadante de cada tubo usando uma micropipeta P-200. Em seguida, use a mesma micropipeta P-200 para adicionar 50 microlitros de PBS a cada tubo.
