Bu protokol, kemirgen kas dokularında iskelet kası interstisyel hücre dışı vezikülleri izole etmeyi ve saflaştırmayı amaçlar. Bu hücre dışı vezikül, tanısal biyobelirteçler ve terapötik araçlar olarak potansiyel uygulama ile kas insan durumu hastalık mekanizması hakkında paha biçilmez bilgiler sağlayacaktır. Bu standartlaştırılmış protokol, iskelet kasından türetilen EV'nin karakteristiğinin, verim, boyut, kargo bileşimi ve işlevi dahil olmak üzere farklı kas örneklerinde analiz edilmesini ve karşılaştırılmasını sağlayacaktır.
Bu sonuçlar, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rollerine ilişkin anlayışımızı ilerletecek ve ayrıca bu EV'lerin tanısal biyobelirteçler olarak uygulanmasını kolaylaştıracaktır. Laboratuvarımız, yüksek saflıkta ve yüksek verimli iskelet kası interstisyel hücre dışı vezikülleri verimli ve zaman açısından etkin bir şekilde güvenilir bir şekilde üretmeye odaklanacaktır. Özellikle nöromusküler bozukluklar bağlamında patolojik rollerini ve terapötik potansiyellerini araştırmayı amaçlıyoruz.
Başlamak için, ötenazi yapılmış fare bacağını, bacağın ön tarafı yukarı bakacak şekilde steril bir plakaya sabitleyin. Diseksiyon makası kullanarak, fare ayak bileğinin yan tarafındaki deride beş milimetrelik küçük bir kesi yapın. Makasın bir bıçağını insizyona sokun, derinin altına, ancak kas dokusunun üzerine yerleştirin.
Ardından, kesiyi uzatmak için cildi dizinize doğru yukarı doğru kesin. Cildi kesi boyunca tutmak için kaba uçlu cımbız kullanın ve kas görünür hale gelene kadar açıklığı genişletmek için geri çekin. Şimdi, tibia kemiğinin yan tarafı boyunca dizden ayak bileğine kadar uzanan tibialis anteriorunu veya TA kasını bulun.
TA kasını kaplayan bağ dokusunu kavramak ve dikkatlice soymak için keskin cımbız kullanın. Ayak bileğinin yakınında, TA kasına bağlı TA tendonunu ve yan taraftaki TA tendonunun yanında bulunan daha küçük EDL tendonunu tanımlayın. Her iki tendonu da kesmek için diseksiyon makası kullanın.
Her iki tendonu da tutmak için kaba uçlu cımbız kullanın. Başka bir cımbızla, TA'yı EDL'den izole ederek tendonları dikkatlice ayırın. Ardından, kaba uçlu cımbız kullanarak TA kasını yeni kesilmiş tendondan kaldırın.
TA tendonunu diz yakınında kesmek için diseksiyon makası kullanın ve kası çıkarın. Şimdi bacağınızı serbest bırakın ve fareyi bacağın arka tarafı yukarı bakacak şekilde çevirin. Derinin bir kısmı zaten çıkarılmış durumdayken, ayak bileğine yakın kalan cildi kesmek için diseksiyon makası kullanın.
Kesilen cildi pürüzlü uçlu cımbızla tutun ve gastroknemius kasını açığa çıkararak dizin arkasına doğru yukarı doğru soyun. Ayak bileğine yakın gastroknemius tendonunu kesmek için diseksiyon makası kullanın. Gastroknemius tendonunu sert uçlu cımbızla kavrayın ve gastroknemius kasının alt tarafını ortaya çıkarmak için yukarı doğru kaldırın.
Daha sonra, gastroknemiusun altında, dize yakın, gastroknemiusun hala bağlı olduğu daha küçük soleus tendonunu bulun. Soleus tendonunu kesmek için diseksiyon makası kullanın ve soleus kasının yukarı doğru kasılmasına izin verin. Kopmuş soleus tendonunu keskin uçlu cımbızla kavrayın ve soleus kasını gastroknemiusun altından ayırmak için hafifçe kaldırın.
Soleusun ucunu, gastroknemiusun kopmuş ucuna bağlandığı ve iki kası tamamen ayırdığı yerden kesmek için diseksiyon makası kullanın. Diseksiyon makası kullanarak, gastroknemiusun ucunu diz kenarından kesin ve buz üzerinde PBS'ye yerleştirin. Dizin altındaki dört kası çıkardıktan sonra, fareyi ön tarafı yukarı bakacak şekilde çevirin.
Kuadriseps kasını esnemeye zorlamak için fare bacağını 90 derecelik bir açıyla konumlandırın. Dize en yakın tendonu kesmek için diseksiyon makası kullanın. Daha sonra, kuadrisepsleri femurdan ayırmak için, sadece proksimal tendon bağlı kalana kadar kas ve kemik arasında kesin.
Diseksiyon makası kullanarak proksimal tendonu kesin ve kuadrisepsleri çıkarın. Kürk ve kan gibi kirleticileri gidermek için çıkarılan tüm kasları PBS ile birkaç kez durulayın. Kağıt havlu kullanarak kasları nazikçe kurulayın.
Keskin uçlu cımbız, kıymık cımbız, neşter veya makas kullanarak tendonları kas örneğinden nazikçe çıkararak başlayın. Daha sonra, makas veya neşter kullanarak, kası kas lifleri boyunca bir tendondan diğerine, bir milimetre kalınlığında parçalar halinde uzunlamasına kesin. Sindirim enzimi tamponu hazırlamak için, iki miligram kollajenaz, mililitre DMEM başına iki enzimi% 1 penisilin streptomisin çözeltisi ile karıştırın.
Karıştırdıktan sonra, çözeltiyi 0.2 mikrometrelik bir filtreden süzün. Kas dokusunu, her biri 20 miligram kas içeren alikotlara ayırın. Enzimatik ayrışma için her bir alikot'a hazırlanan tampondan bir mililitre ekleyin ve inkübe edin.
Yeni 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerini hazırlayın ve etiketleyin. Pistonu beş mililitrelik bir şırıngadan çıkararak 0,45 mikrometrelik bir filtre ayarlayın. Şırınga göbeğini 0,45 mikrometre filtrenin üst ucuna vidalayın ve filtrenin alt ucunu etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
Ardından, karışımı 1000 G'de 10 dakika ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek döküntüleri topaklayın. Süpernatanı şırıngaya aktarmak için bir P-200 mikropipet kullanın. Pistonu şırıngaya tekrar yerleştirdikten sonra, süpernatanı filtreden yavaşça itin ve etiketli 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde toplanmasına izin verin.
Şırınga pistonunu tekrar çıkarın. Bir P-200 mikropipet kullanarak, şırıngaya yaklaşık 200 mikrolitre PBS ekleyin. Pistonu yeniden takın ve kalan süpernatanı etiketli mikrosantrifüj tüpüne akıtmak için 200 mikrolitre PBS'yi filtreden yavaşça itin.
Filtrelenmiş çözeltiyi 200.000 G'ye kadar hızlar için uygun olan yeni 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.Tüpleri kapattıktan sonra, dengeli olduklarından emin olmak için mikro ultrasantrifüjün rotoruna yerleştirin. Mikro ultrasantrifüjü açın ve 100.000 G ve dört santigrat derecede bir saat çalışacak şekilde ayarlayın. Yüklü rotoru, tüplerle birlikte mikro ultrasantrifüjün içine yerleştirin.
İşlemi başlatmak için kapağı kapatın ve vakumu açın. Vakum ikinci seviyeye ulaştığında, başlat düğmesine basın ve santrifüjleme işleminin tamamlanmasını bekleyin. Santrifüjleme döngüsü tamamlandıktan sonra, rotoru ve tüpleri çıkarmadan önce hazneyi yeniden basınçlandırmak için vakum düğmesine tıklayın.
Bir P-200 mikropipet kullanarak süpernatanı her tüpten dikkatlice çıkarın. Ardından, her tüpe 50 mikrolitre PBS eklemek için aynı P-200 mikropipetini kullanın.
