מחקר זה חוקר כיצד שימוש לרעה כרוני באלכוהול משפיע על תפקוד מערכת החיסון של מקרופאגים בנאדיות על-ידי שינוי חילוף החומרים במיטוכונדריה. בסך הכל, המחקר שלנו מדגיש את הצומת של שימוש באלכוהול, מטבוליזם ותפקוד חיסוני, מה שהופך אותו רלוונטי לתחומים כמו אימונולוגיה, פרמקולוגיה ובריאות הציבור. בעוד שלשימוש באלכוהול יש השפעות מזיקות ידועות, המנגנונים המטבוליים הספציפיים ובמיוחד התפקיד של חמצון גלוטמין במקרופאגים בנאדיות אינם מובנים במלואם.
בנוסף, פרוטוקול זה ממלא פער מבחינה מתודולוגית ומאפשר שחזור במחקרים עתידיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידות נשימה מיטוכונדריאלית רגישות בזמן אמת של מספר רב של שכפולים טכניים וביולוגיים. ניתן להתאים אותו לסוגי תאים אחרים והוא אמין יותר להערכת תפקוד מטבולי מאשר טכניקות אחרות שגוזלות זמן רב יותר או דורשות דגימות גדולות יותר.
תוצאות אלה מבהירות את ההשפעה של חשיפה לאתנול על חילוף החומרים של מקרופאג גלוטמין בנאדיות, מה שעשוי להשפיע על התערבויות טיפוליות במחקרים עתידיים. באופן כללי, אנו מצפים לראות שינוי לכיוון הבנת חילוף החומרים של גלוטמין בתאים ומודלים אחרים של מחלות. עבודתנו התמקדה בהבנת האופן שבו מקרופאגים ריאתיים מעכלים מקורות דלק לאנרגיה.
מאחר שמקרופאגים זקוקים לאנרגיה רבה עבור תפקודי מערכת החיסון, כמו איתות לתאי חיסון אחרים ופאגוציטוזה של פתוגנים וסילוקם, הצעדים הבאים שלנו יתמקדו בקישור שינויים במטבוליזם של אנרגיה עם תפקוד מערכת החיסון של מקרופאגים. בתור התחלה, יש ליטול תאי MHS בתרבית שטופלו באתנול במשך 72 שעות וגדלו למפגש של לפחות 50% בצלוחיות T75. צור מפת לוחות עם חמישה עד שישה עותקים טכניים עבור כל שכפול ביולוגי תחת בקרה ובתנאים המטופלים באתנול, כולל בקרות מדיה להשוואת BPTES.
שטפו את התאים במדיה טרייה או PBS כדי להסיר לכלוך ותאים צפים. לאחר מכן הוסיפו שישה מיליליטר של מדיה המכילה סרום לבקבוק T75 כדי להזין את התאים. באמצעות מגרד תאים, לנתק את התאים עד שתחתית הבקבוק ברורה.
מפרידים את התאים המנותקים על ידי פיפטציה שלהם באמצעות פיפטה סרולוגית או פיפטה של מיליליטר. העבירו את התאים המרחפים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-200G למשך שש דקות כדי לגרוף את התאים. לאחר מכן שואפים את הסופרנאטנט מכדורית תא הצנטריפוגה.
הוסף מיליליטר אחד של מדיה לכדור, והשהה מחדש את התאים ביסודיות. מעבירים 10 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה. מוסיפים 10 מיקרוליטר של טריפאן כחול ומערבבים היטב את התמיסה .
כעת, העבירו 10 מיקרוליטר של תערובת התא טריפאן כחול לצד אחד של המוציטומטר או מונה תאים, כדי לספור את התאים. חשב את הדילול הנדרש בהתבסס על מספר הבארות והתאים הדרושים באמצעות הנוסחה המוצגת כאן. לאחר מכן להחיל 80 מיקרוליטר של תאים מרחפים מחדש על הבארות הנדרשות בצלחת microculture שטף חוץ תאי 96 בארות.
דוגרים על התאים למשך הלילה באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר להם להיצמד ולאזן בצלחת. לאחר הטיפול, הסירו את החלק העליון של חבילת השטף החוץ תאי והניחו את החלק הבוחן של חבילת השטף עם הפנים כלפי מעלה על הספסל. יש להחיל 200 מיקרוליטר של תמיסת כיול שטף חוץ-תאי על כל באר בחלק התחתון של מחסנית חבילת השטף החוץ-תאי.
הרכיבו את מחסנית חבילת השטף החוץ-תאי על ידי חיבור מחדש של החלקים ועטיפתם בפרפילם. הניחו את המחסנית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ללא פחמן דו-חמצני, באינקובטור לח או באמבט חרוזים, כדי לאזן את המחסנית. לבסוף, הפעל את המחשב עם עיצוב הבדיקה ופתח את תוכנת הניתוח המחוברת למכשיר bioanalyzer שטף חוץ-תאי.
התחל בבדיקת תאי הבקרה ותאי MHS המטופלים באתנול כדי לוודא שהם בריאים ומודבקים בשכבה אחת מתחת למיקרוסקופ. כדי להכין את מדיום בסיס השטף החוץ תאי, aliquot 35 מיליליטר לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף 350 מיקרוליטר כל אחד של נתרן פירובט 100 מילימולרי, D-גלוקוז וגלוטMAX ליציבות.
מחממים את הפתרון מוכן ל 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו בעדינות את מצע הגידול מצלחת המיקרו-תרבית של השטף החוץ-תאי, תוך השארת מדיה שיורית מינימלית מבלי להפריע לתאים. לשטוף את הבארות עם עד 50 מיקרוליטר של מדיום בסיס שטף תאיים.
לאחר מכן, להוסיף 180 מיקרוליטר של מדיום בסיס שטף חוץ תאי לכל באר. דגרו על צלחת המיקרו-תרבית החוץ-תאית באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ללא פחמן דו-חמצני, למשך 30 דקות עד שעה כדי לאפשר איזון. הוסף 700 מיקרוליטר של תווך בסיס שטף חוץ-תאי לצינור BPTES כדי ליצור תמיסת מלאי של 120 מילימולרי.
פיפטה הפתרון למסיסות נכונה. לאחר מכן, הוסף 630 מיקרוליטר של תווך בסיס שטף חוץ-תאי לצינור האוליגומיצין כדי להכין תמיסת ציר של 100 מילימולרי, וערבב היטב. לאחר מכן הוסף 720 מיקרוליטר של תווך בסיס שטף חוץ-תאי לצינור FCCP כדי להכין תמיסת מלאי של 100 מילימולרי.
פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להמיס כראוי את התרכובת. הוסף 540 מיקרוליטר של תווך בסיס שטף חוץ-תאי לצינור RA כדי להכין תמיסת ציר 50 מילימולרי, וערבב על ידי pipetting. כדי להכין פתרון עבודה BPTES של 30 מיקרומולרית, ערבב 1, 500 מיקרוליטר של מדיום בסיס שטף חוץ-תאי עם 500 מיקרוליטר של תמיסת מלאי BPTES של 120 מילימולרי.
ערבב 2, 520 מיקרוליטר של מדיום בסיס שטף חוץ-תאי עם 480 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אוליגומיצין 100 מילימולרית ליצירת פתרון עבודה של 16 מילימולרי. לאחר מכן הכן את פתרון העבודה של FCCP על ידי ערבוב 2, 865 מיקרוליטר של שטף חוץ-תאי בתוספת מדיום בסיס עם 135 מיקרוליטר של תמיסת מלאי FCCP של 100 מילימולרי. כדי להכין את פתרון העבודה RA, לערבב 2, 700 מיקרוליטר של שטף חוץ-תאי בתוספת מדיום בסיס עם 300 מיקרוליטר של תמיסת מלאי RA 50 מילימולרי.
טען את הרקע, בקרת המדיה והבארות המכילות תאים עם הריאגנטים המוצגים כאן. תאי אתנול ו-BPTES-MHS הציגו קצב צריכת חמצן בסיסי נמוך יותר התלוי בגלוטמין תאים ונשימה מיטוכונדריאלית הקשורה ל-ATP מגלוטמין בהשוואה לתאי ביקורת. תאי אתנול ו-BPTES הפגינו פחות אובדן נשימה מקסימלית וירידה ביכולת הנשימה הרזרבית התלויה בגלוטמין ביחס לתאי הביקורת.
