使用细胞外通量生物分析仪评估谷氨酰胺作为暴露于慢性乙醇的肺泡巨噬细胞的燃料来源

本研究调查了慢性酒精滥用如何通过改变线粒体代谢来影响肺泡巨噬细胞免疫功能。总体而言，我们的研究强调了酒精使用、新陈代谢和免疫功能的交叉点，使其与免疫学、药理学和公共卫生等领域相关。虽然饮酒已知有害影响，但特定的代谢机制，特别是谷氨酰胺氧化在肺泡巨噬细胞中的作用尚不完全清楚。

此外，该协议填补了方法学上的空白，允许在未来的研究中实现可重复性。该协议允许对多个技术和生物学重复进行实时敏感的线粒体呼吸测量。它可以针对其他细胞类型进行调整，并且比其他更耗时或需要更大样本量的技术更可靠地检测代谢功能。

这些结果阐明了乙醇暴露对肺泡巨噬细胞谷氨酰胺代谢的影响，这可能会影响未来研究的治疗干预。总的来说，我们预计会看到人们转向了解细胞谷氨酰胺代谢和其他疾病模型。我们的工作重点是了解肺巨噬细胞如何代谢能量燃料来源。

由于巨噬细胞需要大量能量来维持免疫功能，例如向其他免疫细胞发送信号以及病原体吞噬和清除，因此我们下一步将专注于将能量代谢的变化与巨噬细胞免疫功能联系起来。首先，取用乙醇处理 72 小时的培养 MHS 细胞，并在 T75 培养瓶中生长至至少 50% 汇合。在对照和乙醇处理条件下为每个生物重复创建包含 5 到 6 个技术重复的板图，包括用于 BPTES 比较的培养基对照。

用新鲜培养基或 PBS 冲洗细胞以去除碎片和漂浮细胞。然后向 T75 培养瓶中加入 6 mL 含血清培养基以滋养细胞。使用细胞刮刀分离细胞，直到培养瓶底部透明。

通过使用血清移液管或 1 毫升移液器移液分离分离的细胞。将悬浮细胞转移到 15 mL 锥形管中，以 200G 离心 6 分钟以沉淀细胞。然后从离心细胞沉淀中吸出上清液。

向沉淀中加入 1 毫升培养基，并彻底重悬细胞。将 10 μL 细胞悬液转移到微量离心管中。加入 10 微升台盼蓝，将溶液充分混合。

现在，将 10 μL 细胞台盼蓝混合物转移到血细胞计数器或细胞计数器的一侧，对细胞进行计数。使用此处所示的公式，根据所需的孔和细胞数量计算所需的稀释度。然后将 80 微升重悬细胞施加到 96 孔细胞外通量微培养板中所需的孔中。

将细胞在 37 摄氏度的加湿培养箱中用 5% 二氧化碳孵育过夜，使它们在板中粘附和平衡。处理后，取出细胞外通量填料的顶部，并将助焊剂填料的探测部分正面朝上放在工作台上。将 200 μL 细胞外通量校准液涂抹到细胞外通量填充液柱底部的每个孔中。

通过重新连接切片并将其包裹在 Parafilm 中来组装细胞外助焊剂包盒。将小柱置于 37 °C、非二氧化碳、加湿的培养箱或微珠浴中，以达到平衡。最后，打开具有检测设计的计算机，打开连接到细胞外通量生物分析仪仪器的分析软件。

首先检查对照和乙醇处理的 MHS 细胞，以确保它们健康并在显微镜下粘附在单层中。要制备细胞外通量基础培养基，请将 35 mL 分装到 50 mL 试管中。添加 100 毫摩尔丙酮酸钠、D-葡萄糖和 GlutaMAX 各 350 微升以保持稳定性。

将准备好的溶液加热至 37 摄氏度。然后从细胞外通量微培养板中轻轻吸出生长培养基，留下最少的残留培养基而不会干扰细胞。用多达 50 μL 的细胞外通量基础培养基洗涤孔。

接下来，向每个孔中加入 180 μL 细胞外通量基础培养基。将细胞外微培养板在 37 摄氏度、非二氧化碳、加湿的培养箱中孵育 30 分钟至 1 小时，以实现平衡。向 BPTES 管中加入 700 微升细胞外通量基础培养基，制成 120 毫摩尔的储备溶液。

移液溶液以适当溶解。接下来，向寡霉素管中加入 630 μL 细胞外通量基础培养基，制备 100 毫摩尔的储备溶液，并充分混合。然后将 720 μL 细胞外通量基础培养基添加到 FCCP 管中，以制备 100 毫摩尔的储备溶液。

上下移液 10 次以适当溶解化合物。向 RA 管中加入 540 μL 细胞外通量基础培养基，制备 50 毫摩尔储备溶液，并通过移液混合。要制备 30 微摩尔 BPTES 工作溶液，请将 1， 500 微升细胞外通量基础培养基与 500 微升 120 毫摩尔 BPTES 储备液混合。

将 2， 520 μL 细胞外通量基础培养基与 480 μL 100 毫摩尔寡霉素储备液混合，制成 16 毫摩尔的工作溶液。然后将 2， 865 微升补充细胞外通量的基础培养基与 135 微升 100 毫摩尔 FCCP 储备液混合，制备 FCCP 工作溶液。为了制备 RA 工作溶液，将 2， 700 μL 补充细胞外通量的基础培养基与 300 μL 50 毫摩尔 RA 储备液混合。

使用此处所示的试剂加载背景、培养基对照和含细胞的孔。与对照细胞相比，乙醇和 BPTES-MHS 细胞表现出较低的谷氨酰胺依赖性基础耗氧率细胞和来自谷氨酰胺的 ATP 连接的线粒体呼吸。与对照细胞相比，乙醇和 BPTES 细胞的最大呼吸损失较少，谷氨酰胺依赖性备用呼吸能力降低。