В этом исследовании изучается, как хроническое злоупотребление алкоголем влияет на иммунную функцию альвеолярных макрофагов, изменяя метаболизм митохондрий. В целом, наше исследование подчеркивает взаимосвязь употребления алкоголя, метаболизма и иммунной функции, что делает его актуальным для таких областей, как иммунология, фармакология и общественное здравоохранение. В то время как употребление алкоголя имеет известные вредные последствия, конкретные метаболические механизмы и, в частности, роль окисления глутамина в альвеолярных макрофагах до конца не изучены.
Кроме того, этот протокол заполняет методологический пробел, обеспечивая воспроизводимость в будущих исследованиях. Этот протокол позволяет в режиме реального времени проводить чувствительные измерения митохондриального дыхания нескольких технических и биологических репликатов. Он может быть скорректирован для других типов клеток и более надежен для анализа метаболической функции, чем другие методы, которые требуют больше времени или больших размеров выборки.
Эти результаты проясняют влияние воздействия этанола на метаболизм глютамина в альвеолярных макрофагах, что может повлиять на терапевтические вмешательства в будущих исследованиях. В целом, мы ожидаем увидеть сдвиг в понимании клеточного метаболизма глутамина и других моделей заболеваний. Наша работа была сосредоточена на понимании того, как легочные макрофаги метаболизируют источники топлива для получения энергии.
Поскольку макрофагам требуется много энергии для выполнения иммунных функций, таких как передача сигналов другим иммунным клеткам, фагоцитоз и клиренс патогенов, наши следующие шаги будут сосредоточены на связи сдвигов в энергетическом метаболизме с иммунной функцией макрофагов. Для начала принимайте культивируемые клетки MHS, обработанные этанолом в течение 72 часов и выращенные по крайней мере до 50% конфлюенции в колбах T75. Создание карты планшетов с пятью-шестью техническими репликациями для каждой биологической реплики в контролируемых и обработанных этанолом условиях, включая контрольные среды для сравнения BPTES.
Промойте клетки свежей средой или PBS, чтобы удалить мусор и плавающие клетки. Затем добавьте в колбу Т75 шесть миллилитров среды, содержащей сыворотку, для питания клеток. С помощью скребка для ячеек отсоедините ячейки до тех пор, пока дно колбы не станет чистым.
Отделите отделенные клетки путем пипетирования с помощью серологической пипетки или пипетки объемом один миллилитр. Переложите подвешенные элементы в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при температуре 200G в течение шести минут, чтобы гранулировать клетки. Затем отсасывайте надосадочную жидкость из гранулы ячейки центрифуги.
Добавьте в гранулу один миллилитр среды, и тщательно повторно суспендируйте клетки. Переложите 10 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку. Добавьте 10 микролитров трипанового синего и хорошо перемешайте раствор.
Теперь перенесите 10 микролитров трипановой синей смеси клеток на одну сторону гемоцитометра или счетчика клеток, чтобы подсчитать клетки. Рассчитайте необходимое разубоживание на основе необходимого количества лунок и ячеек, используя приведенную здесь формулу. Затем нанесите 80 микролитров ресуспендированных клеток в необходимые лунки в 96-луночном микрокультуральном планшете для внеклеточного потока.
Инкубируйте клетки в течение ночи в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, чтобы они могли прилипнуть и уравновеситься в планшете. После обработки удалите верхнюю часть внеклеточного флюсового пакета и положите зондированную часть флюсового пакета лицевой стороной вверх на стол. Нанесите по 200 микролитров внеклеточного флюсового калибра на каждую лунку в нижней части картриджа с внеклеточным флюсом.
Соберите картридж с внеклеточным флюсом, снова прикрепив секции и обернув его парапленкой. Поместите картридж в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия без углекислого газа или ванну с шариками, чтобы сбалансировать. Наконец, включите компьютер с дизайном анализа и откройте программное обеспечение для анализа, подключенное к прибору биоанализатора внеклеточного потока.
Начните с проверки контрольных и обработанных этанолом MHS клеток, чтобы убедиться, что они здоровы и прилипают в монослое под микроскопом. Для приготовления внеклеточной флюсовой базовой среды аликвотируем 35 миллилитров в 50-миллилитровую пробирку. Добавьте по 350 микролитров 100-миллимолярного пирувата натрия, D-глюкозы и GlutaMAX для стабильности.
Подогрейте приготовленный раствор до 37 градусов по Цельсию. Затем аккуратно отсасывайте питательную среду из микрокультуральной пластины внеклеточного потока, оставляя минимальное количество остаточной среды, не нарушая клетки. Промойте лунки до 50 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды.
Далее в каждую лунку добавьте по 180 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды. Инкубируйте планшет для внеклеточной микрокультуры в увлажненном инкубаторе без углекислого газа с температурой 37 градусов Цельсия в течение от 30 минут до одного часа, чтобы обеспечить равновесие. Добавьте 700 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды в пробирку BPTES, чтобы получить 120-миллимолярный исходный раствор.
Пипеткой начните раствор для правильной солюбилизации. Далее добавьте в олигомициновую пробирку 630 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды, чтобы приготовить 100-миллимолярный стоковый раствор, и тщательно перемешайте. Затем добавьте 720 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды в пробирку FCCP для приготовления 100-миллимолярного исходного раствора.
Впрыскивайте раствор пипеткой вверх и вниз 10 раз, чтобы правильно растворить соединение. Добавьте 540 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды в пробирку RA, чтобы приготовить 50-миллимолярный исходный раствор, и перемешайте пипеткой. Для приготовления 30-микролярного рабочего раствора BPTES смешайте 1 500 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды с 500 микролитрами 120-миллимолярного исходного раствора BPTES.
Смешайте 2 520 микролитров внеклеточной флюсовой базовой среды с 480 микролитрами 100-миллимолярного олигомицинового стокового раствора для получения 16-миллимолярного рабочего раствора. Затем готовят рабочий раствор ФЦХП путем смешивания 2 865 мк внеклеточной флюсовой основной среды с 135 мкл 100-миллимолярного исходного раствора ФЦХК. Для приготовления рабочего раствора РА смешать 2 700 мк внеклеточной флюсовой основной среды с 300 мкл 50-миллимолярного исходного раствора РА.
Загрузите фон, контроль среды и лунки, содержащие ячейки, показанными здесь реагентами. Этанол и клетки BPTES-MHS демонстрировали более низкую глютамин-зависимую базальную скорость потребления кислорода клетками и АТФ-связанное митохондриальное дыхание от глутамина по сравнению с контрольными клетками. Клетки этанола и BPTES показали меньшую потерю максимального дыхания и снижение глутамин-зависимой резервной дыхательной способности по сравнению с контрольными клетками.
