Cette étude examine comment l’abus chronique d’alcool affecte la fonction immunitaire des macrophages alvéolaires en modifiant le métabolisme mitochondrial. Dans l’ensemble, notre recherche met en évidence l’intersection de la consommation d’alcool, du métabolisme et de la fonction immunitaire, ce qui la rend pertinente pour des domaines tels que l’immunologie, la pharmacologie et la santé publique. Bien que la consommation d’alcool ait des effets néfastes connus, les mécanismes métaboliques spécifiques et en particulier le rôle de l’oxydation de la glutamine dans les macrophages alvéolaires ne sont pas entièrement compris.
De plus, ce protocole comble une lacune méthodologique permettant la reproductibilité dans les études futures. Ce protocole permet des mesures sensibles en temps réel de la respiration mitochondriale de plusieurs réplicats techniques et biologiques. Il peut être ajusté pour d’autres types de cellules et est plus fiable pour doser la fonction métabolique que d’autres techniques qui prennent plus de temps ou nécessitent des échantillons de plus grande taille.
Ces résultats clarifient l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le métabolisme de la glutamine dans les macrophages alvéolaires, ce qui pourrait influencer les interventions thérapeutiques dans les études futures. En général, nous nous attendons à ce qu’une évolution vers la compréhension du métabolisme cellulaire de la glutamine et d’autres modèles de maladies s’améliore. Nos travaux se sont concentrés sur la compréhension de la façon dont les macrophages pulmonaires métabolisent les sources de carburant pour produire de l’énergie.
Étant donné que les macrophages ont besoin de beaucoup d’énergie pour les fonctions immunitaires, comme la signalisation à d’autres cellules immunitaires et la phagocytose et la clairance des agents pathogènes, nos prochaines étapes se concentreront sur le lien entre les changements dans le métabolisme énergétique et la fonction immunitaire des macrophages. Pour commencer, prenez des cellules MHS cultivées traitées à l’éthanol pendant 72 heures et cultivées à au moins 50 % de confluence dans des flacons T75. Créer une carte des plaques avec cinq à six répétitions techniques pour chaque réplication biologique dans des conditions de contrôle et de traitement à l’éthanol, y compris les témoins de milieux pour la comparaison des BPTES.
Rincez les cellules avec un milieu frais ou du PBS pour éliminer les débris et les cellules flottantes. Ajoutez ensuite six millilitres de milieu contenant du sérum dans la fiole T75 pour nourrir les cellules. À l’aide d’un grattoir à cellules, détachez les cellules jusqu’à ce que le fond de la fiole soit clair.
Séparez les cellules détachées en les pipetant à l’aide d’une pipette sérologique ou d’une pipette d’un millilitre. Transférez les cellules en suspension dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-les à 200 G pendant six minutes pour granuler les cellules. Aspirez ensuite le surnageant de la pastille de la cellule de centrifugation.
Ajoutez un millilitre de média à la pastille et remettez soigneusement les cellules en suspension. Transférez 10 microlitres de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation. Ajoutez 10 microlitres de trypan blue et mélangez bien la solution.
Maintenant, transférez 10 microlitres du mélange de bleu trypan cellulaire sur un côté d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules, pour compter les cellules. Calculez la dilution requise en fonction du nombre de puits et de cellules nécessaires à l’aide de la formule présentée ici. Appliquez ensuite 80 microlitres de cellules remises en suspension dans les puits requis dans la plaque de microculture à flux extracellulaire de 96 puits.
Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pour leur permettre d’adhérer et de s’équilibrer dans la plaque. Après le traitement, retirez la partie supérieure du flux extracellulaire et placez la partie sondée du flux pack face vers le haut sur le banc. Appliquez 200 microlitres de solution d’étalonnage de flux extracellulaire dans chaque puits de la partie inférieure de la cartouche de flux extracellulaire.
Assemblez la cartouche de flux pack extracellulaire en rattachant les sections et en l’enveloppant dans Parafilm. Placez la cartouche dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, sans dioxyde de carbone, ou dans un bain de billes, pour équilibrer. Enfin, allumez l’ordinateur avec la conception du test et ouvrez le logiciel d’analyse connecté à l’instrument de bioanalyseur de flux extracellulaire.
Commencez par vérifier les cellules de contrôle et les cellules MHS traitées à l’éthanol pour vous assurer qu’elles sont saines et qu’elles adhèrent en monocouche au microscope. Pour préparer le milieu de base de flux extracellulaire, aliquote 35 millilitres dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez 350 microlitres chacun de pyruvate de sodium de 100 millimolaires, de D-glucose et de GlutaMAX pour plus de stabilité.
Réchauffez la solution préparée à 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirez doucement le milieu de croissance de la plaque de microculture de flux extracellulaire, en laissant un minimum de milieu résiduel sans perturber les cellules. Lavez les puits avec jusqu’à 50 microlitres de fluide de base de flux extracellulaire.
Ensuite, ajoutez 180 microlitres de milieu de base de flux extracellulaire dans chaque puits. Incuber la plaque de microculture extracellulaire dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, sans dioxyde de carbone, pendant 30 minutes à une heure pour permettre l’équilibre. Ajoutez 700 microlitres de fluide de base de flux extracellulaire dans le tube BPTES pour obtenir une solution mère de 120 millimolaires.
Pipetez la solution pour une bonne solubilisation. Ensuite, ajoutez 630 microlitres de milieu de base de flux extracellulaire dans le tube d’oligomycine pour préparer une solution mère de 100 millimolaires et mélangez soigneusement. Ajoutez ensuite 720 microlitres de fluide de base de flux extracellulaire dans le tube FCCP pour préparer une solution mère de 100 millimolaires.
Pipetez la solution de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé. Ajouter 540 microlitres de fluide de base de flux extracellulaire dans le tube RA pour préparer une solution mère de 50 millimolaires et mélanger par pipetage. Pour préparer une solution de travail de BPTES de 30 micromolaires, mélangez 1 500 microlitres de milieu de base de flux extracellulaire avec 500 microlitres de solution mère de BPTES de 120 millimolaires.
Mélangez 2 520 microlitres de milieu de base de flux extracellulaire avec 480 microlitres de solution mère d’oligomycine de 100 millimolaires pour créer une solution de travail de 16 millimolaires. Préparez ensuite la solution de travail FCCP en mélangeant 2 865 microlitres de milieu de base complété par un flux extracellulaire avec 135 microlitres de solution mère FCCP de 100 millimolaires. Pour préparer la solution de travail de l’AR, mélangez 2 700 microlitres de milieu de base complété par le flux extracellulaire avec 300 microlitres de solution mère d’AR de 50 millimolaires.
Chargez l’arrière-plan, le contrôle du milieu et les puits contenant les cellules avec les réactifs illustrés ici. Les cellules à l’éthanol et BPTES-MHS ont montré un taux de consommation d’oxygène de base dépendant de la glutamine plus faible et une respiration mitochondriale liée à l’ATP de la glutamine par rapport aux cellules témoins. Les cellules éthanol et BPTES ont montré moins de perte de respiration maximale et une capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine réduite par rapport aux cellules témoins.
