In dieser Studie wird untersucht, wie sich chronischer Alkoholmissbrauch auf die Immunfunktion der Alveolarmakrophagen auswirkt, indem er den mitochondrialen Stoffwechsel verändert. Insgesamt hebt unsere Forschung die Schnittstelle von Alkoholkonsum, Stoffwechsel und Immunfunktion hervor, was sie für Bereiche wie Immunologie, Pharmakologie und öffentliche Gesundheit relevant macht. Während Alkoholkonsum bekannte schädliche Auswirkungen hat, sind die spezifischen Stoffwechselmechanismen und insbesondere die Rolle der Glutaminoxidation in Alveolarmakrophagen nicht vollständig verstanden.
Darüber hinaus schließt dieses Protokoll eine methodische Lücke, die eine Reproduzierbarkeit in zukünftigen Studien ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht in Echtzeit empfindliche Messungen der mitochondrialen Atmung mehrerer technischer und biologischer Replikate. Es kann für andere Zelltypen angepasst werden und ist zuverlässiger für die Bestimmung der Stoffwechselfunktion als andere Techniken, die zeitaufwändiger sind oder größere Probengrößen erfordern.
Diese Ergebnisse verdeutlichen den Einfluss der Ethanol-Exposition auf den Glutaminstoffwechsel von Alveolarmakrophagen, was therapeutische Interventionen in zukünftigen Studien beeinflussen könnte. Im Allgemeinen erwarten wir eine Verschiebung hin zum Verständnis des zellulären Glutaminstoffwechsels und anderer Krankheitsmodelle. Unsere Arbeit konzentrierte sich auf das Verständnis, wie Lungenmakrophagen Brennstoffquellen zur Energiegewinnung verstoffwechseln.
Da Makrophagen viel Energie für Immunfunktionen benötigen, wie z. B. die Signalübertragung an andere Immunzellen und die Phagozytose und Clearance von Krankheitserregern, werden sich unsere nächsten Schritte darauf konzentrieren, Verschiebungen im Energiestoffwechsel mit der Immunfunktion von Makrophagen zu verknüpfen. Nehmen Sie zunächst kultivierte MHS-Zellen, die 72 Stunden lang mit Ethanol behandelt und in T75-Kolben auf mindestens 50 % Konfluenz gezüchtet wurden. Erstellen Sie eine Plattenkarte mit fünf bis sechs technischen Replikaten für jedes biologische Replikat unter kontrollierten und mit Ethanol behandelten Bedingungen, einschließlich Medienkontrollen für den BPTES-Vergleich.
Spülen Sie die Zellen mit frischem Medium oder PBS, um Schmutz und schwimmende Zellen zu entfernen. Geben Sie dann sechs Milliliter serumhaltiges Medium in den T75-Kolben, um die Zellen zu nähren. Die Zellen werden mit einem Zellschaber gelöst, bis der Boden des Kolbens frei ist.
Trennen Sie die abgelösten Zellen, indem Sie sie mit einer serologischen Pipette oder einer Ein-Milliliter-Pipette pipettieren. Übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie sechs Minuten lang bei 200 G, um die Zellen zu pelletieren. Anschließend wird der Überstand aus dem Pellet der Zentrifugenzelle abgesaugt.
Geben Sie einen Milliliter Medium zum Pellet und suspendieren Sie die Zellen gründlich wieder. Übertragen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 10 Mikroliter Trypanblau hinzu und mischen Sie die Lösung gut.
Übertragen Sie nun 10 Mikroliter der Zelltrypanblau-Mischung auf eine Seite eines Hämozytometers oder eines Zellzählers, um die Zellen zu zählen. Berechnen Sie die erforderliche Verdünnung basierend auf der Anzahl der benötigten Wells und Zellen mit der hier gezeigten Formel. Geben Sie dann 80 Mikroliter der resuspendierten Zellen in die erforderlichen Vertiefungen in der 96-Well-Mikrokulturplatte für extrazelluläre Flussmittel.
Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem 37 Grad Celsius feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, damit sie in der Platte haften und sich ausgleichen können. Entfernen Sie nach der Behandlung den oberen Teil des extrazellulären Flussmittelpakets und legen Sie den sondierten Teil des Flussmittelpakets mit der Vorderseite nach oben auf die Bank. Tragen Sie 200 Mikroliter extrazelluläre Flussmittelkalibrierungslösung auf jede Vertiefung im unteren Teil der extrazellulären Flussmittelpack-Kartusche auf.
Montieren Sie die extrazelluläre Flux-Pack-Kartusche, indem Sie die Abschnitte wieder anbringen und mit Parafilm umwickeln. Legen Sie die Kartusche zum Ausgleich in einen 37 Grad Celsius heißen, kohlendioxidfreien Befeuchtungsinkubator oder ein Perlbad. Schalten Sie abschließend den Computer mit dem Assay-Design ein und öffnen Sie die Analysesoftware, die mit dem extrazellulären Flussbioanalysator verbunden ist.
Beginnen Sie damit, die Kontroll- und Ethanol-behandelten MHS-Zellen unter dem Mikroskop zu überprüfen, um sicherzustellen, dass sie gesund sind und in einer Monoschicht haften. Zur Herstellung des extrazellulären Flussmittel-Basismediums aliquotieren Sie 35 Milliliter in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie jeweils 350 Mikroliter 100-Millimolar-Natriumpyruvat, D-Glucose und GlutaMAX hinzu, um die Stabilität zu gewährleisten.
Erwärmen Sie die vorbereitete Lösung auf 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie dann das Wachstumsmedium vorsichtig von der extrazellulären Flussmittel-Mikrokulturplatte, wobei nur minimale Restmedien übrig bleiben, ohne die Zellen zu stören. Waschen Sie die Vertiefungen mit bis zu 50 Mikrolitern extrazellulärem Flussmittel-Basismedium.
Geben Sie anschließend 180 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die extrazelluläre Mikrokulturplatte in einem 37 Grad Celsius heißen, kohlendioxidfreien Inkubator für 30 Minuten bis eine Stunde, um eine Äquilibrierung zu ermöglichen. Geben Sie 700 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium in das BPTES-Röhrchen, um eine 120-Millimolar-Stammlösung herzustellen.
Pipettieren Sie die Lösung, um die richtige Solubilisierung zu gewährleisten. Geben Sie als nächstes 630 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium in das Oligomycin-Röhrchen, um eine 100-millimolare Stammlösung herzustellen, und mischen Sie gründlich. Geben Sie dann 720 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium in das FCCP-Röhrchen, um eine 100-millimolare Stammlösung herzustellen.
Pipettieren Sie die Lösung 10 Mal auf und ab, um die Verbindung richtig aufzulösen. Geben Sie 540 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium in das RA-Röhrchen, um eine 50-millimolare Stammlösung herzustellen, und mischen Sie durch Pipettieren. Zur Herstellung einer 30-mikromolaren BPTES-Arbeitslösung mischen Sie 1.500 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium mit 500 Mikrolitern 120-millimolarer BPTES-Stammlösung.
Mischen Sie 2.520 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel-Basismedium mit 480 Mikrolitern 100-Millimolar-Oligomycin-Stammlösung, um eine 16-Millimolar-Arbeitslösung herzustellen. Bereiten Sie dann die FCCP-Arbeitslösung vor, indem Sie 2.865 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel, das mit Basismedium ergänzt ist, mit 135 Mikrolitern 100-Millimolar-FCCP-Stammlösung mischen. Zur Herstellung der RA-Arbeitslösung werden 2.700 Mikroliter extrazelluläres Flussmittel, das mit Basismedium supplementiert ist, mit 300 Mikrolitern 50-Millimolar-RA-Stammlösung gemischt.
Laden Sie den Hintergrund, die Mediensteuerung und die zellhaltigen Wells mit den hier gezeigten Reagenzien. Ethanol- und BPTES-MHS-Zellen wiesen im Vergleich zu Kontrollzellen einen geringeren glutaminabhängigen basalen Sauerstoffverbrauch und eine ATP-gekoppelte mitochondriale Atmung aus Glutamin auf. Ethanol- und BPTES-Zellen zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen einen geringeren Verlust an maximaler Atmung und eine verringerte glutaminabhängige freie Atmungskapazität.
