تبحث هذه الدراسة في كيفية تأثير إساءة استخدام الكحول المزمنة على وظيفة المناعة في البلاعم السنخية عن طريق تغيير عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا. بشكل عام ، يسلط بحثنا الضوء على تقاطع تعاطي الكحول والتمثيل الغذائي ووظيفة المناعة ، مما يجعله ذا صلة بمجالات مثل علم المناعة والصيدلة والصحة العامة. في حين أن تعاطي الكحول له آثار ضارة معروفة ، فإن آليات التمثيل الغذائي المحددة وخاصة دور أكسدة الجلوتامين في البلاعم السنخية ليست مفهومة تماما.
بالإضافة إلى ذلك ، يملأ هذا البروتوكول فجوة منهجية تسمح بالتكرار في الدراسات المستقبلية. يسمح هذا البروتوكول بقياسات تنفس الميتوكوندريا الحساسة في الوقت الفعلي للعديد من التكرارات التقنية والبيولوجية. يمكن تعديله لأنواع الخلايا الأخرى وهو أكثر موثوقية لفحص وظيفة التمثيل الغذائي من التقنيات الأخرى التي تستغرق وقتا أطول أو تتطلب أحجام عينات أكبر.
توضح هذه النتائج تأثير التعرض للإيثانول على استقلاب الجلوتامين البلاعم السنخي ، مما قد يؤثر على التدخلات العلاجية في الدراسات المستقبلية. بشكل عام ، نتوقع أن نرى تحولا نحو فهم استقلاب الجلوتامين الخلوي ونماذج الأمراض الأخرى. ركز عملنا على فهم كيفية استقلاب البلاعم الرئوية لمصادر الوقود للحصول على الطاقة.
نظرا لأن البلاعم تحتاج إلى الكثير من الطاقة لوظائف المناعة ، مثل إرسال إشارات إلى الخلايا المناعية الأخرى وبلعمة مسببات الأمراض وإزالتها ، فإن خطواتنا التالية ستركز على ربط التحولات في استقلاب الطاقة بوظيفة المناعة للبلاعم. للبدء ، خذ خلايا MHS المستنبتة المعالجة بالإيثانول لمدة 72 ساعة ونمت إلى ما لا يقل عن 50٪ من التقاء في قوارير T75. قم بإنشاء خريطة لوحة تحتوي على خمسة إلى ستة مكررات تقنية لكل تكرار بيولوجي تحت السيطرة وظروف معالجة بالإيثانول ، بما في ذلك عناصر التحكم في الوسائط لمقارنة BPTES.
اشطف الخلايا بوسائط جديدة أو PBS لإزالة الحطام والخلايا العائمة. ثم أضف ستة ملليلتر من الوسائط المحتوية على المصل إلى قارورة T75 لتغذية الخلايا. باستخدام مكشطة الخلية ، افصل الخلايا حتى يصبح الجزء السفلي من القارورة واضحا.
افصل الخلايا المنفصلة عن طريق ماصتها باستخدام ماصة مصلية أو ماصة سعة مليلتر واحد. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 200 جرام لمدة ست دقائق لتكسير الخلايا. ثم استنشق المادة الطافية من حبيبات خلية الطرد المركزي.
أضف ملليلتر واحد من الوسائط إلى الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا جيدا. انقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 10 ميكرولترات من التريبان الأزرق واخلط المحلول جيدا.
الآن ، انقل 10 ميكرولترات من خليط الخلية الأزرق إلى جانب واحد من مقياس الدم أو عداد الخلايا ، لحساب الخلايا. احسب التخفيف المطلوب بناء على عدد الآبار والخلايا المطلوبة باستخدام الصيغة الموضحة هنا. ثم ضع 80 ميكرولترا من الخلايا المعاد تعليقها على الآبار المطلوبة في لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية المكونة من 96 بئرا.
احتضان الخلايا طوال الليل في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح لها بالالتصاق والتوازن في اللوحة. بعد العلاج ، قم بإزالة الجزء العلوي من حزمة التدفق خارج الخلية وضع الجزء الذي تم فحصه من حزمة التدفق ووجهه لأعلى على المقعد. ضع 200 ميكرولتر من محلول التدفق خارج الخلية على كل بئر في الجزء السفلي من خرطوشة حزمة التدفق خارج الخلية.
قم بتجميع خرطوشة حزمة التدفق خارج الخلية عن طريق إعادة توصيل الأقسام ولفها في Parafilm. ضع الخرطوشة في حاضنة 37 درجة مئوية أو غير ثاني أكسيد الكربون أو حاضنة مرطب أو حمام حبة للتوازن. أخيرا ، قم بتشغيل الكمبيوتر بتصميم الفحص وافتح برنامج التحليل المتصل بأداة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية.
ابدأ بفحص خلايا التحكم والخلايا MHS المعالجة بالإيثانول للتأكد من أنها صحية وملتصقة في طبقة أحادية تحت المجهر. لتحضير وسط قاعدة التدفق خارج الخلية ، قم بتخزين 35 مل في أنبوب سعة 50 مل. أضف 350 ميكرولتر لكل من بيروفات الصوديوم 100 ملليمولار و D-glucose و GlutaMAX لتحقيق الاستقرار.
قم بتسخين المحلول المحضر إلى 37 درجة مئوية. ثم استنشق وسط النمو برفق من لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية ، مع ترك الحد الأدنى من الوسائط المتبقية دون إزعاج الخلايا. اغسل الآبار بما يصل إلى 50 ميكرولترا من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية.
بعد ذلك ، أضف 180 ميكرولترا من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية إلى كل بئر. احتضان صفيحة الاستزراع الدقيق خارج الخلية في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، غير ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة للسماح بالتوازن. أضف 700 ميكرولتر من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية إلى أنبوب BPTES لعمل محلول مخزون 120 ملليمول.
الماصة الحل للذوبان المناسب. بعد ذلك ، أضف 630 ميكرولترا من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية إلى أنبوب oligomycin لتحضير محلول مخزون 100 ملليمولار ، واخلطه جيدا. ثم أضف 720 ميكرولترا من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية إلى أنبوب FCCP لتحضير محلول مخزون 100 ملليمول.
قم بعرض المحلول لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح. أضف 540 ميكرولترا من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية إلى أنبوب RA لتحضير محلول مخزون 50 مليمولي ، واخلطه عن طريق سحب العينات. لتحضير محلول عمل BPTES بسعة 30 ميكرومولار ، امزج 1،500 ميكرولتر من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية مع 500 ميكرولتر من محلول مخزون BPTES سعة 120 ملليمول.
امزج 2،520 ميكرولتر من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية مع 480 ميكرولتر من محلول مخزون أوليغومايسين 100 ملليمولار لإنشاء محلول عمل 16 ملليمول. ثم قم بإعداد محلول عمل FCCP عن طريق خلط 2،865 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 135 ميكرولتر من محلول مخزون FCCP 100 مللي مولار. لتحضير محلول عمل RA ، امزج 2،700 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 300 ميكرولتر من محلول مخزون RA سعة 50 ملليمول.
قم بتحميل الخلفية والتحكم في الوسائط والآبار المحتوية على الخلايا باستخدام الكواشف الموضحة هنا. أظهرت خلايا الإيثانول و BPTES-MHS معدل استهلاك أقل للأكسجين القاعدي المعتمد على الجلوتامين وتنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP من الجلوتامين مقارنة بالخلايا الضابطة. أظهرت خلايا الإيثانول و BPTES خسارة أقل في أقصى قدر من التنفس وانخفاض القدرة التنفسية الاحتياطية المعتمدة على الجلوتامين مقارنة بالخلايا الضابطة.
