Este estudio investiga cómo el abuso crónico de alcohol afecta la función inmune de los macrófagos alveolares al alterar el metabolismo mitocondrial. En general, nuestra investigación destaca la intersección del consumo de alcohol, el metabolismo y la función inmunológica, lo que la hace relevante para campos como la inmunología, la farmacología y la salud pública. Si bien el consumo de alcohol tiene efectos perjudiciales conocidos, los mecanismos metabólicos específicos y, en particular, el papel de la oxidación de la glutamina en los macrófagos alveolares no se comprenden completamente.
Además, este protocolo llena un vacío metodológico que permite la reproducibilidad en estudios futuros. Este protocolo permite mediciones sensibles de la respiración mitocondrial en tiempo real de múltiples réplicas técnicas y biológicas. Se puede ajustar para otros tipos de células y es más fiable para analizar la función metabólica que otras técnicas que requieren más tiempo o tamaños de muestra más grandes.
Estos resultados aclaran el impacto de la exposición al etanol en el metabolismo de la glutamina de los macrófagos alveolares, lo que puede influir en las intervenciones terapéuticas en estudios futuros. En general, esperamos ver un cambio hacia la comprensión del metabolismo celular de la glutamina y otros modelos de enfermedades. Nuestro trabajo se ha centrado en comprender cómo los macrófagos pulmonares metabolizan las fuentes de combustible para obtener energía.
Dado que los macrófagos necesitan mucha energía para sus funciones inmunitarias, como la señalización a otras células inmunitarias y la fagocitosis y eliminación de patógenos, nuestros próximos pasos se centrarán en vincular los cambios en el metabolismo energético con la función inmunitaria de los macrófagos. Para empezar, tome células MHS cultivadas tratadas con etanol durante 72 horas y cultivadas hasta al menos un 50% de confluencia en matraces T75. Cree un mapa de placas con cinco a seis réplicas técnicas para cada réplica biológica bajo control y condiciones tratadas con etanol, incluidos los controles de medios para la comparación de BPTES.
Enjuague las celdas con medios nuevos o PBS para eliminar los desechos y las celdas flotantes. A continuación, añada seis mililitros de medios que contengan suero al matraz T75 para nutrir las células. Con un raspador de células, separe las células hasta que el fondo del matraz esté transparente.
Separe las células desprendidas pipeteándolas con una pipeta serológica o una pipeta de un mililitro. Transfiera las celdas suspendidas a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 200 g durante seis minutos para peletizar las celdas. A continuación, aspire el sobrenadante del pellet de la célula centrífuga.
Agregue un mililitro de medio al gránulo y vuelva a suspender las células completamente. Transfiera 10 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Agrega 10 microlitros de azul de tripano y mezcla bien la solución.
Ahora, transfiera 10 microlitros de la mezcla de azul de tripano celular a un lado de un hemocitómetro o un contador de células, para contar las células. Calcule la dilución requerida en función del número de pocillos y celdas necesarios utilizando la fórmula que se muestra aquí. A continuación, aplique 80 microlitros de las células resuspendidas a los pocillos requeridos en la placa de microcultivo de flujo extracelular de 96 pocillos.
Incube las células durante la noche en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono para permitir que se adhieran y se equilibren en la placa. Después del tratamiento, retire la parte superior del paquete de flujo extracelular y coloque la parte sondeada del paquete de flujo boca arriba en el banco. Aplique 200 microlitros de solución calibradora de flujo extracelular a cada pocillo en la parte inferior del cartucho del paquete de flujo extracelular.
Ensamble el cartucho del paquete de flujo extracelular volviendo a colocar las secciones y envolviéndolo en Parafilm. Coloque el cartucho en una incubadora humidificada sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados o en un baño de perlas, para mantener el equilibrio. Finalmente, encienda la computadora con el diseño del ensayo y abra el software de análisis conectado al instrumento bioanalizador de flujo extracelular.
Comience por verificar las células MHS de control y tratadas con etanol para asegurarse de que estén sanas y adheridas en una monocapa bajo un microscopio. Para preparar el medio base de flujo extracelular, alícuota 35 mililitros en un tubo de 50 mililitros. Agregue 350 microlitros de piruvato de sodio de 100 milimolares, D-glucosa y GlutaMAX para mayor estabilidad.
Calentar la solución preparada a 37 grados centígrados. A continuación, aspire suavemente el medio de crecimiento de la placa de microcultivo de flujo extracelular, dejando un mínimo de medios residuales sin alterar las células. Lave los pocillos con hasta 50 microlitros de medio base de flujo extracelular.
A continuación, agregue 180 microlitros de medio base de flujo extracelular a cada pocillo. Incubar la placa de microcultivo extracelular en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius, sin dióxido de carbono, durante 30 minutos a una hora para permitir el equilibrio. Agregue 700 microlitros de medio base de flujo extracelular al tubo BPTES para hacer una solución madre de 120 milimolares.
Pipetear la solución para una correcta solubilización. A continuación, agregue 630 microlitros de medio base de flujo extracelular al tubo de oligomicina para preparar una solución madre de 100 milimolares y mezcle bien. A continuación, añada 720 microlitros de medio base de fundente extracelular al tubo FCCP para preparar una solución madre de 100 milimolares.
Pipetea la solución hacia arriba y hacia abajo 10 veces para solubilizar adecuadamente el compuesto. Agregue 540 microlitros de medio base de flujo extracelular al tubo de AR para preparar una solución madre de 50 milimolares y mezcle por pipeteo. Para preparar una solución de trabajo de BPTES de 30 micromolares, mezcle 1.500 microlitros de medio base de flujo extracelular con 500 microlitros de solución madre de BPTES de 120 milimolares.
Mezcle 2.520 microlitros de medio base de flujo extracelular con 480 microlitros de solución madre de oligomicina de 100 milimolares para crear una solución de trabajo de 16 milimolares. A continuación, prepare la solución de trabajo de FCCP mezclando 2.865 microlitros de medio base suplementado con flujo extracelular con 135 microlitros de solución madre de FCCP de 100 milimolares. Para preparar la solución de trabajo de AR, mezcle 2.700 microlitros de medio base suplementado con flujo extracelular con 300 microlitros de solución madre de AR de 50 milimolares.
Cargue los pocillos de fondo, control de medios y contenedores de celdas con los reactivos que se muestran aquí. Las células de etanol y BPTES-MHS mostraron una tasa de consumo de oxígeno basal dependiente de glutamina más baja y una respiración mitocondrial ligada a ATP de la glutamina en comparación con las células de control. Las células de etanol y BPTES mostraron una menor pérdida en la respiración máxima y una menor capacidad respiratoria ociosa dependiente de glutamina en relación con las células de control.
