이 연구는 만성 알코올 남용이 미토콘드리아 대사를 변화시켜 폐포 대식세포 면역 기능에 어떤 영향을 미치는지 조사합니다. 전반적으로 우리의 연구는 알코올 사용, 신진대사 및 면역 기능의 교차점을 강조하여 면역학, 약리학 및 공중 보건과 같은 분야와 관련이 있습니다. 알코올 사용은 해로운 영향을 미치는 것으로 알려져 있지만, 특정 대사 메커니즘, 특히 폐포 대식세포에서 글루타민 산화의 역할은 완전히 이해되지 않았습니다.
또한 이 프로토콜은 방법론적으로 격차를 메워 향후 연구에서 재현성을 허용합니다. 이 프로토콜을 사용하면 여러 기술 및 생물학적 복제에 대한 실시간 민감성 미토콘드리아 호흡 측정이 가능합니다. 다른 세포 유형에 맞게 조정할 수 있으며 시간이 더 많이 걸리거나 더 큰 샘플 크기가 필요한 다른 기술보다 대사 기능을 분석하는 데 더 신뢰할 수 있습니다.
이러한 결과는 에탄올 노출이 폐포 대식세포 글루타민 대사에 미치는 영향을 명확히 하며, 이는 향후 연구에서 치료 개입에 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로 세포 글루타민 대사 및 기타 질병 모델을 이해하는 방향으로 전환될 것으로 예상됩니다. 우리의 연구는 폐 대식세포가 어떻게 연료원을 에너지로 대사하는지 이해하는 데 중점을 두었습니다.
대식세포는 다른 면역 세포에 대한 신호 전달, 병원체 식세포 작용 및 청소와 같은 면역 기능을 위해 많은 에너지를 필요로 하기 때문에 다음 단계는 에너지 대사의 변화를 대식세포 면역 기능과 연결하는 데 중점을 둘 것입니다. 시작하려면 72시간 동안 에탄올로 처리하고 T75 플라스크에서 최소 50% 밀도로 성장시킨 배양 MHS 세포를 가져옵니다. BPTES 비교를 위한 매체 제어를 포함하여 제어 하에 있는 각 생물학적 복제 및 에탄올 처리 조건에 대해 5-6개의 기술 복제가 포함된 플레이트 맵을 생성합니다.
새 매체 또는 PBS로 세포를 헹구어 파편과 부유 세포를 제거합니다. 그런 다음 T75 플라스크에 6ml의 혈청 함유 배지를 추가하여 세포에 영양을 공급합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크 바닥이 깨끗해질 때까지 셀을 분리합니다.
혈청학적 피펫 또는 1밀리리터 피펫을 사용하여 분리된 세포를 피펫팅하여 분리합니다. 부유 세포를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 옮기고 200G에서 6분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 원심분리기 셀 펠릿에서 상층액을 흡인합니다.
펠릿에 1ml의 매체를 추가하고 세포를 완전히 다시 부유시킵니다. 10 마이크로리터의 셀 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 트리판 블루 10마이크로리터를 넣고 용액을 잘 섞는다.
이제 10 마이크로리터의 세포 트리판 블루 혼합물을 혈구계 또는 세포 카운터의 한쪽 면에 옮겨 세포 수를 세습니다. 여기에 표시된 공식을 사용하여 필요한 웰과 세포의 수를 기준으로 필요한 희석을 계산합니다. 그런 다음 80 마이크로리터의 재부유 세포를 96웰 세포외 플럭스 미세배양 플레이트의 필요한 웰에 적용합니다.
이산화탄소가 5% 함유된 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 세포를 밤새 배양하여 플레이트에 부착하고 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 치료 후, 세포외 플럭스 팩의 상단 부분을 제거하고 플럭스 팩의 프로브 부분을 위로 향하게 벤치에 놓습니다. 200 마이크로리터의 세포외 플럭스 보정 용액을 세포외 플럭스 팩 카트리지의 바닥 부분에 있는 각 웰에 적용합니다.
세포외 플럭스 팩 카트리지를 단면을 다시 부착하고 Parafilm으로 감싸서 조립합니다. 카트리지를 섭씨 37도, 이산화탄소가 없는 가습 인큐베이터 또는 비드 배스에 넣어 평형을 맞춥니다. 마지막으로, 분석 설계가 있는 컴퓨터를 켜고 세포외 플럭스 바이오분석기 기기에 연결된 분석 소프트웨어를 엽니다.
먼저 대조군 및 에탄올 처리된 MHS 세포를 확인하여 건강하고 현미경으로 단층에 부착되어 있는지 확인합니다. 세포외 플럭스 염기 배지를 준비하려면 35밀리리터를 50밀리리터 튜브에 분주합니다. 안정성을 위해 100밀리몰 피루브산 나트륨, D-포도당 및 GlutaMAX를 각각 350마이크로리터씩 추가합니다.
준비된 용액을 섭씨 37도까지 데운다. 그런 다음 세포외 플럭스 미세배양 플레이트에서 성장 배지를 부드럽게 흡인하여 세포를 방해하지 않고 최소한의 잔류 배지를 남깁니다. 최대 50 마이크로리터의 세포외 플럭스 베이스 배지로 웰을 세척합니다.
다음으로, 180 마이크로리터의 세포외 플럭스 염기 배지를 각 웰에 추가합니다. 세포외 미세배양판을 섭씨 37도의 비이산화탄소 가습 인큐베이터에서 30분에서 1시간 동안 배양하여 평형을 이룹니다. 700 마이크로리터의 세포외 플럭스 염기 배지를 BPTES 튜브에 첨가하여 120밀리몰 스톡 용액을 만듭니다.
적절한 용해를 위해 용액을 피펫팅합니다. 다음으로, 630 마이크로리터의 세포외 플럭스 베이스 배지를 올리고마이신 튜브에 첨가하여 100밀리몰 원액을 준비하고 철저히 혼합합니다. 그런 다음 720 마이크로리터의 세포외 플럭스 베이스 매질을 FCCP 튜브에 첨가하여 100밀리몰 원액을 준비합니다.
화합물을 적절하게 용해시키기 위해 용액을 위아래로 10번 피펫팅합니다. 540 마이크로리터의 세포외 플럭스 염기 배지를 RA 튜브에 첨가하여 50밀리몰 원액을 준비하고 피펫팅으로 혼합합니다. 30 마이크로 몰 BPTES 작업 용액을 준비하려면 1, 500 마이크로 리터의 세포 외 플럭스 염기 매체와 500 마이크로 리터의 120 밀리몰 BPTES 원액을 혼합하십시오.
2, 520 마이크로리터의 세포외 플럭스 염기 배지와 480 마이크로리터의 100밀리몰 올리고마이신 스톡 용액을 혼합하여 16 밀리몰 작업 용액을 만듭니다. 그런 다음 2, 865 마이크로 리터의 세포 외 플럭스 보충 기본 매체를 135 마이크로 리터의 100 밀리 몰 FCCP 스톡 용액과 혼합하여 FCCP 작업 용액을 준비합니다. RA 작동 용액을 준비하기 위해, 2, 700 마이크로 리터의 세포외 플럭스 보충 기본 매체를 300 마이크로 리터의 50 밀리몰 RA 원액과 혼합하십시오.
background, media control 및 cell-containing wells에 여기에 표시된 시약을 로드합니다. 에탄올 및 BPTES-MHS 세포는 대조 세포에 비해 글루타민 의존성 기초 산소 소비율 세포와 글루타민에 의한 ATP 결합 미토콘드리아 호흡이 더 낮았습니다. 에탄올 및 BPTES 세포는 대조군 세포에 비해 최대 호흡 손실이 적고 글루타민 의존성 예비 호흡 능력이 감소했습니다.
