Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto

Riepilogo

Qui presentiamo come esporre il ganglio genicolato di un topo da laboratorio vivo e anestetizzato e come utilizzare l'imaging del calcio per misurare le risposte degli insiemi di questi neuroni agli stimoli del gusto, consentendo prove multiple con diversi stimolanti. Ciò consente confronti approfonditi di quali neuroni rispondono a quali tastants.

Abstract

Negli ultimi dieci anni, i progressi negli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) hanno promosso una rivoluzione nell'imaging funzionale in vivo. Utilizzando il calcio come proxy per l'attività neuronale, queste tecniche forniscono un modo per monitorare le risposte delle singole cellule all'interno di grandi insiemi neuronali a una varietà di stimoli in tempo reale. Noi, e altri, abbiamo applicato queste tecniche per immaginare le risposte dei singoli neuroni gangliali genicolati agli stimoli gustavi applicati alle lingue di topi vivi anestetizzati. Il ganglio genicolato è composto dai corpi cellulari dei neuroni gustativi che innervano la lingua e il palato anteriori e da alcuni neuroni somatosensoriali che innervano la pinna dell'orecchio. L'imaging delle risposte evocate dal gusto dei singoli neuroni gangliosi genicolati con GCaMP ha fornito importanti informazioni sui profili di sintonizzazione di questi neuroni nei topi wild-type e un modo per rilevare i fenotipi di errore di gusto periferico nei topi geneticamente manipolati. Qui dimostriamo la procedura chirurgica per esporre il ganglio genicolato, l'acquisizione dell'immagine di fluorescenza GCaMP, i passaggi iniziali per l'analisi dei dati e la risoluzione dei problemi. Questa tecnica può essere utilizzata con GCaMP codificato transgenicamente o con espressione GCaMP mediata da AAV e può essere modificata per l'immagine di particolari sottoinsiemi genetici di interesse (ad esempio, espressione GCaMP mediata da Cre). Nel complesso, l'imaging del calcio in vivo dei neuroni gangliari genicolati è una tecnica potente per monitorare l'attività dei neuroni gustativi periferici e fornisce informazioni complementari alle registrazioni più tradizionali della corda timpani a nervi interi o ai saggi del comportamento del gusto.

Introduzione

Un componente chiave del sistema gustatico periferico dei mammiferi è il ganglio genicolato. Oltre ad alcuni neuroni somatosensoriali che innervano la pinna dell'orecchio, il genicolato è costituito dai corpi cellulari dei neuroni gustativi che innervano la lingua e il palato anteriori. Simile ad altri neuroni sensoriali periferici, i neuroni gangliogenici sono pseudo-unipolari con un lungo assone che si proietta perifericamente verso le papille gustative e centralmente verso il nucleo del tronco cerebrale del tratto solitario¹. Questi neuroni sono attivati principalmente dal rilascio di ATP da parte delle cellule del recettore del gusto che ri....

Protocollo

I protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas a San Antonio.

1. Configurazione pre-operatoria

NOTA: Si prega di notare che la configurazione iniziale dell'apparecchiatura non è affrontata qui, in quanto varierà in base al sistema di pompaggio, al microscopio, alla fotocamera e al software di imaging utilizzato. Per le istruzioni di configurazione, fare riferimento ai materiali didattici forniti dal fornitore dell'apparecchiatura. Per le attrezzature utilizzate dagli autori, si prega di consultare la Tabella ....

Risultati

Seguendo il protocollo, un animale transgenico Snap25-GCaMP6s è stato sedato, i gangli genicolati sono stati esposti e il tastant è stato applicato alla lingua durante la registrazione del video. Lo scopo dell'esperimento era quello di definire quali tastants hanno suscitato risposte da ciascuna cellula. I tanci (30 mM AceK, 5 mM chinino, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM acido citrico)¹⁸ sono stati disciolti in acqua DI e sono stati applicati alla lingua per 2 s separati da 13 s di acqua .......

Discussione

Questo lavoro descrive un protocollo passo-passo per esporre chirurgicamente il ganglio genicolato e registrare visivamente l'attività dei suoi neuroni con GCaMP6s. Questa procedura è molto simile a quella descritta in precedenza¹⁷, con alcune eccezioni degne di nota. In primo luogo, l'uso di un palo della testa consente una facile regolazione del posizionamento della testa durante l'intervento chirurgico. In secondo luogo, per quanto riguarda la consegna dello stimolo, l'approccio di Wu e Dvory.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 x #5 Inox Forceps	Fine Science Tools	NC9792102
1ml Syringe with luer lock	Fisher Scientific	14-823-30
2 x #3 Inox Forceps	Fine Science Tools	M3S 11200-10
27 Gauge Blunt Dispensing Needle	Fisher Scientific	NC1372532
3M Vetbond	Fisher Scientific	NC0398332
4-40 Machine Screw Hex Nuts	Fastenere	3SNMS004C
4-40 Socket Head Cap Screw	Fastenere	3SSCS04C004
Absorbent Points	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfame K	Fisher Scientific	A149025G
Artificial Tears	Akorn	59399-162-35
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle	Fisher Scientific	14-829-6D
Blunt Retractors	FST	18200-09
Breadboard	Thor Labs	MB8
Citric Acid	Fisher Scientific	A95-3
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Contemporary Ortho-Jet Liquid	Lang	1504
Contemporary Ortho-Jet Powder	Lang	1520
Cotton Tipped Applicators	Fisher	19-062-616
Custom Head Post Holder	eMachineShop		See attached file 202410.ems
Custom Metal Head Post	eMachineShop		See attached file 202406.ems
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted	Hamamatsu	C13440
Disection Scope	Leica	M80
Hair Clippers	Kent Scientific	CL7300-Kit
IMP	Fisher Scientific	AAJ6195906
Ketamine	Ketaved	NDC 50989-996-06
LED Cold Light Source	Leica Mcrosystems	KL300LED
Luer Lock 1/16" Tubing Adapters	Fisher	01-000-116
Microscope	Olympus	BX51WI
Mini-series Optical Posts	Thorlabs	MS2R
MPG	Fisher Scientific	AAA1723230
MXC-2.5 Rotatable probe Clamp	Siskiyou	14030000E
NaCl	Fisher Scientific	50-947-346
petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713A
Pressurized air	Airgas	AI Z300
Quinine	Fisher Scientific	AC163720050
Self Sticking Labeling Tape	Fisher Scientific	159015R
Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot)	Automate Scientific	05-14
Sola SM Light Engine	Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	025111
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Surgical Probe	Roboz Surgical Store	RS-6067
Surgical Probe Holder	Roboz Surgical Store	RS-6061
Thread	Gütermann	02776
BD Intramedic Tubing	Fisher Scientific	22-046941
Two Stage Gas Regulator	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon vinyl tubing - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 digital/manual controller	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System	Automate Scientific	17-pp-54
Xylazine	Anased	NADA# 139-236