Un saggio di attività accoppiata enzimatica ad alto rendimento per sondare l'interazione di piccole molecole con la dNTPasi SAMHD1

Riepilogo

SAMHD1 è un deossinucleoside trifosfato trifoidrolasi con ruoli critici nella salute e nelle malattie umane. Qui presentiamo un versatile saggio di attività SAMHD1 accoppiato ad enzimi, distribuito in un formato di micropiastra a 384 pozzetti, che consente la valutazione di piccole molecole e analoghi nucleotidici come substrati, attivatori e inibitori di SAMHD1.

Abstract

Il motivo alfa sterile e la proteina 1 contenente il dominio HD (SAMHD1) è un regolatore fondamentale dei pool intracellulari di deossinucleosidi trifosfato (dNTP), poiché questo enzima può idrolizzare i dNTP nei loro corrispondenti nucleosidi e trifosfati inorganici. A causa del suo ruolo critico nel metabolismo dei nucleotidi, della sua associazione a diverse patologie e del suo ruolo nella resistenza alla terapia, sono attualmente in corso intense ricerche per una migliore comprensione sia della regolazione che della funzione cellulare di questo enzima. Per questo motivo, lo sviluppo di metodi semplici ed economici ad alto rendimento per sondare l'interazione di piccole molecole con SAMHD1, come regolatori allosterici, substrati o inibitori, è vitale. A questo scopo, il saggio del verde di malachite accoppiato enzimatico è un saggio colorimetrico semplice e robusto che può essere utilizzato in un formato di piastra da 384 micropozzetti che consente la misurazione indiretta dell'attività di SAMHD1. Poiché SAMHD1 rilascia il gruppo trifosfato dai substrati nucleotidici, possiamo accoppiare un'attività di pirofosfatasi a questa reazione, producendo così fosfato inorganico, che può essere quantificato dal reagente verde malachite attraverso la formazione di un complesso verde di fofosfomolibdato malachite. Qui, mostriamo l'applicazione di questa metodologia per caratterizzare gli inibitori noti di SAMHD1 e per decifrare i meccanismi coinvolti nella catalisi di SAMHD1 di substrati non canonici e nella regolazione da parte di attivatori allosterici, esemplificati da farmaci antitumorali a base di nucleosidi. Pertanto, il saggio del verde di malachite accoppiato enzimatico è un potente strumento per studiare SAMHD1 e, inoltre, potrebbe anche essere utilizzato nello studio di diversi enzimi che rilasciano specie di fosfato.

Introduzione

Il motivo alfa sterile e la proteina 1 contenente il dominio istidina-aspartato (SAMHD1) è un regolatore centrale dell'omeostasi nucleotidica nelle cellule di mammifero¹ con molti ruoli nella salute e nella malattia umana². Questo enzima è in grado di idrolizzare i deossinucleosidi trifosfati (dNTP) nelle loro molecole affini di deossinucleoside e trifosfato inorganico ^3,4, con questa attività regolata allostericamente dall'abbondanza di (d)NTP (esaminata nel riferimento⁵). Ogni monomero SAMHD1 contiene due siti allosterici (AS1 e AS2) e un sito catalitico, e la formazione dell'enzima attivo richiede l'assemblaggio ordinato di un omotetramero al legame (d)NTP. La dimerizzazione dei monomeri SAMHD1 viene prima innescata attraverso il legame di un trifosfato di guanina (GTP o dGTP) ad AS1 e la successiva tetramerizzazione si ottiene quando un'ulteriore molecola di dNTP si lega ad AS2, consentendo l'accesso del substrato al sito catalitico e la successiva idrolisi.

I substrati di SAMHD1 includono i quattro dNTP canonici ^3,4 insieme ad alcuni nucleotidi modificati con basi e zuccheri, inclusi i metaboliti trifosfato di diversi farmaci a base di nucleosidi utilizzati nel trattamento delle infezioni virali e del cancro, molti dei quali possono anche fungere da attivatori allosterici ^{6,7,8,9,10,11}. Di conseguenza, SAMHD1 modula l'efficacia di molti di questi composti nei modelli di malattia 7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, inoltre, nel caso dell'analogo della deossicitidina citarabina (ara-C), che è rimasta per decenni la terapia standard per la leucemia mieloide acuta (LMA), in realtà detta Efficacia del trattamento in questa malattia ^7,8,16. SAMHD1 è quindi un potenziale biomarcatore e bersaglio terapeutico per migliorare l'efficacia delle terapie a base di nucleosidi¹⁷ e, di conseguenza, noi e altri abbiamo cercato di identificare strategie per inattivare SAMHD1 nelle cellule. Abbiamo proposto l'uso della proteina virale X (Vpx) come inibitore biologico per colpire SAMHD1 per la degradazione all'interno delle cellule tumorali⁷, tuttavia, questo approccio ha una serie di limitazioni (discusse nel riferimento¹²), e recentemente abbiamo anche riportato un approccio indiretto per sopprimere l'attività di SAMHD1 attraverso l'inibizione della ribonucleotide reduttasi che abbiamo dimostrato in vari modelli di LMA¹⁸. Un certo numero di studi ha cercato di identificare piccole molecole in grado di inibire direttamente SAMHD1 e, ad oggi, diverse di queste molecole sono state riportate, tuttavia, documentando solo l'inibizione in vitro 6,9,19,20,21,22. Di conseguenza, la mancanza di piccole molecole che inibiscono potentemente l'attività di SAMHD1 nelle cellule, unita ai complessi meccanismi di catalisi di SAMHD1 di terapie a base di nucleosidi, sottolinea la necessità di ulteriori indagini. Pertanto, metodi robusti e idealmente ad alto rendimento per sondare l'interazione di piccole molecole con SAMHD1 sono ideali per identificare substrati, regolatori allosterici e inibitori di questo enzima clinicamente rilevante.

Sono disponibili diverse metodologie che misurano direttamente l'attività della dNTPasi di SAMHD1, come la cromatografia su strato sottile (TLC)^9,20,23 e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)^9,21, ma queste non sono prontamente suscettibili a configurazioni ad alto rendimento. Un'eccezione è il saggio riportato da Mauney et al., che sfrutta la capacità di SAMHD1 di idrolizzare il bis (4-nitrofenil) fosfato (b4NPP) a p-nitrofenolo e p-nitrofenilfosfato quando Mn²⁺ viene utilizzato come catione attivante, con conseguente cambiamento colorimetrico che può essere prontamente misurato in una piastra a micropozzetti²¹. Questo saggio è stato utilizzato con successo per l'identificazione e la caratterizzazione degli inibitori di SAMHD1, ma va notato che l'idrolisi si verifica in assenza di attivatori (d)NTP e in presenza di un probabile catione attivante non fisiologico, entrambi importanti avvertimenti da considerare. Ciò rende questo test meno applicabile allo studio e all'identificazione di regolatori allosterici di SAMHD1.

In questo contesto, un approccio accoppiato enzimatico combinato con il reagente verde della malachite, come dettagliato in questo rapporto, può essere un metodo versatile per misurare indirettamente l'attività dNTPasica di SAMHD1 e, inoltre, interrogare l'impatto di varie piccole molecole su di esso. Il saggio del verde di malachite è una tecnica colorimetrica robusta e affidabile per la rilevazione del fosfato inorganico libero (Pi), basata sulla formazione di un complesso di acido molibdofosforico che porta a una variazione colorimetrica misurata a 620 nm²⁴. Poiché l'idrolisi di SAMHD1 rilascia il gruppo trifosfato dai substrati nucleotidici, è quindi necessario accoppiare questa reazione con un'attività di (piro)fosfatasi, che genererà fosfato inorganico libero, prima dell'aggiunta del reagente verde malachite. Il saggio del verde di malachite è sensibile ed economico ed è stato ampiamente utilizzato per l'identificazione e la caratterizzazione di inibitori e substrati per enzimi che rilasciano gruppi fosfato inorganici nelle loro reazioni o in presenza di un enzima di accoppiamento. È stato ampiamente applicato nella caratterizzazione delle attività dell'ATPasi delle elicasi 25,26,27 o nello studio dell'attività enzimatica di CD73, che media la degradazione dell'AMP in adenosina e fosfato inorganico ²⁸. Inoltre, quando accoppiato, è stato impiegato nella scoperta di farmaci antibiotici che hanno come bersaglio la UDP-2,3-diacilglucosamina pirofosfatasi LpxH, un enzima essenziale nella maggior parte dei patogeni Gram-negativi²⁹. Per quanto riguarda la ricerca sul cancro, l'approccio accoppiato enzimatico è stato ampiamente utilizzato contro le idrolasi NUDIX, una famiglia di enzimi che metabolizzano i nucleotidi, sia nella caratterizzazione dei substrati 30,31,32 che nell'identificazione e sviluppo di farmaci e sonde chimiche 33,34,35,36.

Per quanto riguarda la dNTPasi SAMHD1, questo approccio è stato utilizzato in diversi rapporti. Utilizzando l'esopolifosfatasi Ppx1 di Saccharomyces cerevisiae come enzima di accoppiamento, questo test è stato utilizzato per testare diversi analoghi nucleotidici come substrati, attivatori o inibitori di SAMHD1 e ha portato all'identificazione del metabolita trifosfato del farmaco antileucemico clofarabina come attivatore e substrato⁶. Inoltre, con la pirofosfatasi inorganica di Escherichia coli come enzima di accoppiamento, è stata impiegata nello screening di una libreria di composti clinicamente approvati contro SAMHD1 per identificare gli inibitori²⁰. Nella nostra ricerca, abbiamo utilizzato questo approccio per dimostrare che ara-CTP, il metabolita attivo di ara-C, è un substrato di SAMHD1 ma non un attivatore allosterico⁷ e successivamente abbiamo utilizzato questo test per dimostrare che diverse piccole molecole che potrebbero sensibilizzare i modelli di LMA ad ara-C in modo SAMHD1-dipendente, in realtà non inibiscono direttamente SAMHD1¹⁸. In questo rapporto, descriveremo in dettaglio questo metodo versatile e ne dimostreremo l'applicabilità, in una configurazione ad alto rendimento, per l'identificazione di inibitori, attivatori e substrati di SAMHD1.

Protocollo

Una panoramica schematica dei metodi riportati di seguito è illustrata nella Figura 1 e un elenco dettagliato dei materiali e dei reagenti è disponibile nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei tamponi di saggio.

1. Preparazione dei tamponi di riserva.
   NOTA: Poiché il test è sensibile al rilevamento di fosfati, che possono essere comuni, sciacquare la vetreria tre volte con acqua ultrapura o bidistillata per evitare contaminazioni. Tutti i tamponi possono essere conservati a temperatura ambiente (RT).
   1. Preparare 1 L di soluzione madre tampone di reazione (RB) SAMHD1 (25 mM Tris-Acetato pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) sciogliendo 4,5 g di Tris Acetato, 2,3 g NaCl e 0,2 g MgCl₂ in circa 800 ml di acqua prima di regolare a pH 8 e volume finale.
   2. Preparare 5 mL di soluzione madre di TCEP 0,1 M diluendo 1 mL di TCEP 0,5 M in 4 mL di acqua.
   3. Preparare 50 mL di soluzione madre Tween-20 all'11% diluendo 5 mL di Tween-20 al 100% in 44,5 mL di acqua.
      NOTA: Tween-20 è sensibile alla luce.
   4. Preparare 50 mL di soluzione 0,5 M di EDTA stop sciogliendo 9,3 g di EDTA in circa 40 mL di acqua prima di regolare a pH 8 e al volume finale.
   5. Preparare la soluzione madre di verde di malachite (MG) (3,2 mM di verde malachite in H₂SO₄) aggiungendo lentamente 60 ml di acido solforico concentrato a 300 ml di acqua in un flacone di vetro marrone. Raffreddare la soluzione a RT e sciogliere 0,44 g di verde malachite.
      CAUTELA: La reazione dell'acido solforico con l'acqua è esotermica e quindi la bottiglia può riscaldarsi provocando un accumulo di pressione; Assicurarsi che questa pressione venga rilasciata frequentemente.
      NOTA: La soluzione arancione risultante è sensibile alla luce (quindi bottiglia marrone) e stabile per almeno 1 anno a RT. Il precipitato può formarsi nel tempo, assicurarsi che venga utilizzato solo il surnatante.
   6. Preparare 50 ml di soluzione madre di molibdato di ammonio al 7% sciogliendo 3,75 g di molibdato di ammonio in 50 mL di acqua.
      NOTA: Il precipitato può formarsi nel tempo, assicurarsi che venga utilizzato solo il surnatante.
2. Preparazione di tamponi per saggi completi
   NOTA: Questo dovrebbe essere fatto il giorno dell'esperimento
   1. Preparare SAMHD1 RB completo (25 mM Tris-Acetato pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20). Utilizzare le scorte Tween-20 all'11% e TCEP da 0,1 M preparate in precedenza per aggiungere questi componenti a una concentrazione finale dello 0,005% per Tween-20 e di 0,3 mM per TCEP allo stock RB SAMHD1.
   2. Preparare la soluzione di arresto dell'EDTA (25 mM Tris-Acetato pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 mM EDTA). Per completare SAMHD1 RB, utilizzare una soluzione madre di EDTA 0,5 M per aggiungere EDTA a una concentrazione finale di 7,9 mM.
   3. Preparare la soluzione di lavoro MG (2,5 mM di verde malachite, 1,4% molibdato di ammonio, 0,18% Tween-20) mescolando 10 parti di soluzione madre MG con 2,5 parti di molibdato di ammonio al 7% e 0,2 parti di Tween-20 all'11%.

2. Saggio di inibizione di SAMHD1 e determinazione del composto IC₅₀

NOTA: Le condizioni finali del test sono mostrate nella Tabella 1.

1. Preparazione dei composti nella piastra di analisi
   NOTA: I composti a piccolo peso molecolare sono tipicamente disciolti in DMSO al 100% e analoghi nucleotidici in acqua. La concentrazione di stock varia da 10 a 100 mM ed è influenzata dalla potenza e dalla solubilità dei composti, insieme alla tolleranza DMSO del saggio. Verificare che la concentrazione finale di DMSO nella reazione non superi l'1% per garantire che le attività enzimatiche non siano influenzate da questo solvente. È buona norma testare la tolleranza del saggio al solvente prima dell'esperimento.
   1. Preparare composti in esame diluiti in serie a una concentrazione finale di 100 volte superiore nel solvente pertinente (ad esempio, DMSO al 100% per piccole molecole o acqua per analoghi nucleotidici) in una piastra trasparente a 96 pozzetti in polipropilene a fondo tondo utilizzando una pipetta multicanale o un'apparecchiatura automatizzata per la manipolazione dei liquidi.
      NOTA: A seconda della stabilità del composto, le piastre di diluizione possono essere preparate in anticipo, sigillate e conservate a -20 °C. Lasciare che le piastre si equilibrino in RT prima di continuare il protocollo.
   2. Utilizzando il RB SAMHD1 completo, diluire i composti a 25 volte la concentrazione finale (per mantenere la concentrazione finale del solvente al di sotto dell'1%) e trasferire 5 μL nei pozzetti appropriati di una piastra di analisi trasparente a fondo piatto da 384 pozzetti. Ripetere la procedura con campioni di controllo contenenti solo solvente.
2. Preparazione dei componenti di reazione
   NOTA: Questa operazione deve essere eseguita il giorno stesso del test. Le aliquote umane ricombinanti SAMHD1 ed E. coli pirofosfatasi (PPasi) sono conservate a lungo termine a -80 °C diluite rispettivamente a 9,1 mg/mL e 23,0 mg/mL in tampone di conservazione (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glicerolo, 2 mM TCEP). Una volta scongelate, le aliquote vengono conservate a breve termine a -20 °C.
   1. Preparare la miscela madre dell'enzima (SAMHD1/PPasi) diluendo la proteina SAMHD1 umana ricombinante e la PPasi ricombinante in SAMHD1 RB completo fino a 4 volte la concentrazione finale desiderata, quindi 1,4 μM SAMHD1 e 50 U/mL PPasi.
   2. Preparare il dGTP attivatore/substrato diluendo lo stock di dGTP (tipicamente 10 o 100 mM in acqua) in SAMHD1 RB completo alla concentrazione finale 2x, quindi 50 μM dGTP.
3. Eseguire il test
   NOTA: Tutti i componenti del saggio devono essere bilanciati in RT. Le aggiunte di liquidi possono essere eseguite con una pipetta multicanale o con un dosatore di liquidi per reagenti sfusi.
   1. Su una piastra del saggio a 384 pozzetti contenente diluizioni composte e controlli di solo solvente, erogare 5 μL di miscela master SAMHD1/PPasi. Per non utilizzare pozzetti di controllo enzimatico, erogare 5 μL di SAMHD1 RB completo. Pre-incubare l'enzima e i composti per 10 minuti a RT.
   2. Su tutti i pozzetti, erogare 10 μL di soluzione 2x dGTP per avviare la reazione.
   3. Incubare la reazione per 20 minuti a RT.
   4. Arrestare la reazione erogando 20 μL di soluzione di arresto EDTA a tutti i pozzetti.
      NOTA: Se lo si desidera, l'esperimento può essere messo in pausa qui.
   5. Aggiungere 10 μL di soluzione di lavoro MG a tutti i pozzetti.
      CAUTELA: La soluzione di lavoro MG contiene acido solforico.
   6. Assicurare la miscelazione del contenuto del pozzetto utilizzando un agitatore orbitale per piastre a micropozzetti e centrifugazione a 1.000 x g per 1 minuto.
   7. Incubare la piastra per 20 minuti a RT.
   8. Leggere l'assorbimento alla lunghezza d'onda di 630 nm in un lettore di piastre a micropozzetti.
4. Visualizzazione e analisi dei dati
   1. Calcolare la media e la deviazione standard dei pozzetti di controllo positivi e negativi (positiva, reazione completa con solvente; negativa, dGTP da solo con solvente). Calcolare il fattore Z³⁷ come indicatore della qualità del saggio.
   2. Normalizzare ogni valore di assorbanza ai valori medi dei controlli positivo e negativo, impostando il controllo positivo come attività SAMHD1 al 100% e il controllo negativo come attività SAMHD1 allo 0%.
   3. Tracciare il grafico dell'attività di SAMHD1 (%) in funzione della concentrazione del composto e adattare una curva dose-risposta a pendenza variabile a quattro parametri, consentendo la determinazione del composto IC₅₀.

3. Attivatore SAMHD1 e schermo del substrato

NOTA: Le condizioni finali del test sono mostrate nella Tabella 2. Le aliquote ricombinanti di SAMHD1 e PPasi sono conservate a lungo termine a -80 °C diluite rispettivamente a 9,1 mg/mL e 23,0 mg/mL in tampone di conservazione (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10% glicerolo, 2 mM TCEP) a -80 °C. Una volta scongelate, le aliquote vengono conservate a breve termine a -20 °C.

1. Preparazione di analoghi nucleotidici nella piastra di saggio
   1. Diluire le scorte di analoghi nucleotidici (tipicamente 10 o 100 mM in acqua) alla concentrazione finale 4x nel RB SAMHD1 completo, nel nostro caso l'analogo nucleotidico da 800 μM, e trasferire 5 μL nei pozzetti appropriati di una piastra di analisi a 384 pozzetti.
2. Preparazione dei componenti di reazione
   NOTA: Questa operazione deve essere eseguita il giorno stesso del test
   1. Preparare la miscela madre dell'enzima (SAMHD1/PPasi) diluendo la proteina SAMHD1 umana ricombinante e la PPasi ricombinante di E. coli in SAMHD1 RB completo fino a 2 volte la concentrazione finale desiderata, quindi 0,7 μM SAMHD1 e 25 U/mL PPasi.
   2. Preparare la soluzione di PPasi da sola diluendo la PPasi ricombinante di E. coli in SAMHD1 RB completo fino a 2 volte la concentrazione finale desiderata, quindi 25 U/mL di PPasi.
   3. Preparare gli attivatori GTP (AS1) e dGTPαS (AS1 e AS2) diluendo lo stock (tipicamente 10 o 100 mM in acqua) in SAMHD1 RB completo a 4 volte la concentrazione finale, quindi 50 μM GTP o dGTPαS.
3. Eseguire il test
   NOTA: Tutti i componenti del saggio devono essere bilanciati in RT. Le aggiunte di liquidi possono essere eseguite con una pipetta multicanale o con un dosatore di liquidi per reagenti sfusi.
   1. Su una piastra del saggio a 384 pozzetti contenente analoghi nucleotidici, erogare 5 μL dell'attivatore (GTP o dGTPαS) o completare SAMHD1 RB nei pozzetti appropriati.
   2. Iniziare la reazione erogando 10 μL di miscela master SAMHD1/PPasi, PPasi da sola o SAMHD1 RB completa nei pozzetti appropriati.
   3. Incubare la reazione per 20 minuti a RT.
   4. Arrestare la reazione erogando 20 μL di soluzione di arresto EDTA a tutti i pozzetti.
      NOTA: Se lo si desidera, l'esperimento può essere messo in pausa qui.
   5. Aggiungere 10 μL di soluzione di lavoro MG a tutti i pozzetti.
      CAUTELA: La soluzione di lavoro MG contiene acido solforico.
   6. Assicurare la miscelazione del contenuto del pozzetto utilizzando un agitatore orbitale per piastre a micropozzetti e centrifugazione a 1.000 x g per 1 minuto.
   7. Incubare la piastra per 20 minuti a RT.
   8. Leggere l'assorbimento alla lunghezza d'onda di 630 nm in un lettore di piastre a micropozzetti.
4. Visualizzazione e analisi dei dati
   1. Calcolare i valori medi di assorbanza per i pozzetti di reazione solo PPasi (controllo negativo o segnale di fondo).
      NOTA: Come controllo positivo di un attivatore allosterico SAMHD1 e di un substrato, il dGTP può essere incluso nella piastra. In questo caso, è possibile utilizzare questa condizione per calcolare il fattore Z come indicatore della qualità del saggio.
   2. Sottrarre il valore di fondo dai pozzetti corrispondenti nelle reazioni SAMHD1/PPasi.
   3. Tracciare i valori di assorbanza corretti per ciascun analogo nucleotidico con condizioni tampone, GTP e dGTPαS.

Risultati

Il protocollo delineato nella Figura 1 descrive il flusso di lavoro di base per l'utilizzo del saggio verde di malachite accoppiato enzimatico per sondare l'interazione di piccole molecole con la dNTPasi SAMHD1 e può essere adattato in diversi modi per interrogare diverse domande biochimiche. Nei risultati rappresentativi discussi nei paragrafi seguenti, illustriamo esempi di utilizzo di questo test per determinare le proprietà inibitorie di piccole molecole nei confronti di SAMHD1 e per verificare se diversi analoghi nucleotidici sono substrati e/o attivatori di questo enzima.

I risultati mostrati nella Figura 2 illustrano diversi principi fondamentali di questo saggio. Il reagente verde di malachite consente la rilevazione colorimetrica del fosfato inorganico attraverso la formazione di un complesso verde di malachite fosfomolibdato e, di conseguenza, questo approccio può essere applicato allo studio di reazioni enzimatiche il cui prodotto è fosfato. Per dimostrare la sensibilità di questo metodo alla rilevazione del fosfato inorganico libero, la Figura 2A mostra i valori di assorbanza ottenuti con concentrazioni crescenti di Na₃PO₄ dopo un'incubazione di 20 minuti con il reagente verde malachite. Mentre il segnale raggiunge la saturazione a 0,25 mM Na₃PO₄, l'intervallo di rilevamento lineare del fosfato è visibile da 0,004 a 0,03 mM (Figura 2A, pannello di destra), in accordo con altri studi che hanno riportato un intervallo lineare del fosfato fino a 10-20 μM utilizzando il saggio del verde malachite³⁸.

SAMHD1 è una dNTPasi che rilascia trifosfato inorganico durante l'idrolisi di una molecola di dNTP, e quindi per generare fosfato inorganico libero per il rilevamento da parte del verde malachite, è necessario un enzima di accoppiamento. La pirofosfatasi inorganica (PPasi) da E. coli si è dimostrata utile a questo scopo, sia per quanto riguarda SAMHD1 ^7,20, ma anche altri enzimi metabolizzanti nucleotidici 30,33,35. Inoltre, SAMHD1 è una dNTPasi attiva quando è un omotetramero, e questo richiede l'attivazione allosterica da parte di (d)NTP, in particolare un trifosfato di guanina (GTP o dGTP) ad AS1 e qualsiasi dNTP ad AS2. Successivamente, il sito catalitico diventa accessibile per il legame del substrato e avviene la reazione enzimatica. Poiché il dGTP soddisfa i requisiti per il legame con AS1 e AS2 ed è un substrato, l'uso di questo nucleotide nel saggio di inibizione semplifica notevolmente il flusso di lavoro. La Figura 2B illustra il requisito dei diversi componenti del saggio di ottenere un'attività SAMHD1 misurabile, indicata da un aumento dell'assorbanza a 630 nm. Né SAMHD1 né PPasi da soli sono in grado di generare fosfato inorganico in presenza di dGTP, coerentemente con le attività documentate di questi enzimi. Tuttavia, nella condizione in cui sono presenti tutti i componenti del saggio (SAMHD1, PPasi e l'attivatore/substrato dGTP) osserviamo un aumento del segnale. Il fattore Z³⁷ dell'esempio mostrato qui (senza enzimi + dGTP come controllo negativo e SAMHD1/PPasi + dGTP come controllo positivo) era 0,74, indicando un test robusto.

Una delle potenziali applicazioni del saggio di attività SAMHD1 accoppiato enzimatico è l'identificazione di inibitori attraverso lo screening ad alto rendimento (HTS). Pertanto, in questo rapporto, convalidiamo il rilevamento dell'inibizione di SAMHD1 in questo test utilizzando un insieme diversificato di composti già descritti in letteratura. Seamon et al. hanno valutato l'inibizione dose-dipendente dei nucleosidi canonici verso SAMHD1 utilizzando un test simile a quello mostrato qui e hanno scoperto che la deossiguanosina (dGuo) era l'unico nucleoside canonico in grado di inibire significativamente SAMHD1, con un valore IC₅₀ di 488 μM²⁰. Un HTS di farmaci approvati dalla FDA eseguito con il test diretto di b4NPP ha rivelato diversi risultati che hanno inibito l'attività di SAMHD1 a concentrazioni micromolari, da cui la lomofungina è stata la molecola che ha inibito più potentemente l'attività della dNTPasi SAMHD1 in vitro, esibendo un IC₅₀ di 20,1 μM quando determinato in presenza di dGTP come substrato²¹. Inoltre, i quattro analoghi α,β-imido-dNTP sono stati identificati come inibitori competitivi di SAMHD1 utilizzando il sensore MDCC-PBP e SAMHD1 accoppiato all'attività di Ppx, il che ha dimostrato che le costanti inibitorie degli analoghi di dNMPNPP erano nell'intervallo micromolare basso / nanomolare alto ^6,22. Pertanto, per dimostrare che il saggio di attività di SAMHD1 accoppiato all'enzima può essere utilizzato per identificare gli inibitori di SAMHD1, sono stati utilizzati dGuo, lomofungina e 2'-deossitimidina-5'-[(α,β)-imido]trifosfato (dTMPNPP), per convalidare la tecnica. La Figura 3A illustra le curve dose-risposta ottenute per questi composti, mostrando che concentrazioni crescenti inibiscono efficacemente l'attività di SAMHD1. I valori medi di IC₅₀ ottenuti per queste molecole da tre esperimenti indipendenti (± deviazione standard) sono stati i seguenti: dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungina 6,78 ± 3,9 μM e dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. Come esempio di risultato negativo, è stato determinato anche l'impatto dell'idrossiurea (HU) sull'attività di SAMHD1. HU è un inibitore della ribonucleotide reduttasi e, sebbene limiti l'attività dell'ara-CTPasi di SAMHD1 in vari modelli di LMA, gli effetti di HU su SAMHD1 hanno dimostrato di essere indiretti e si basano sulla perturbazione della regolazione allosterica di SAMHD1¹⁸. La curva dose-risposta di HU è mostrata nella Figura 3B e non sono stati osservati cambiamenti nell'attività di SAMHD1 con l'aumento delle dosi di HU, dimostrando che HU non inibisce l'attività di SAMHD1 in vitro.

Un altro uso del saggio di attività SAMHD1 accoppiato enzimatico è quello di indagare se i nucleotidi e i loro analoghi sono substrati e/o attivatori allosterici di questo enzima, come illustrato nella Figura 4. In questo esperimento, i nucleotidi canonici, così come i metaboliti attivi di diversi analoghi nucleosidici antitumorali, come la citarabina (ara-CTP), la clofarabina (Cl-F-ara-ATP) e la gemcitabina (dF-dCTP), sono stati testati come substrati e attivatori di SAMHD1. A causa della complessa regolazione allosterica di SAMHD1, la reazione viene eseguita in presenza di GTP come attivatore di AS1 o dell'analogo non idrolizzabile della dGTP 2'-deossiguanosina-5'-(α-tio)-trifosfato (dGTPαS), che può occupare AS1 e AS2. L'attività di SAMHD1 in presenza dell'analogo nucleotidico testato e del GTP indica che il nucleotide è in grado di legarsi al sito allosterico secondario e al sito catalitico (cioè l'attivatore e il substrato di AS2), mentre l'attività di SAMHD1 con l'analogo nucleotidico e dGTPαS indica che il nucleotide può occupare solo il sito catalitico (cioè solo un substrato). Se il nucleotide è in grado di legarsi sia ai siti allosterici AS1 e AS2 che al sito catalitico, SAMHD1 sarà attivo in presenza del solo nucleotide, come mostrato nel caso del dGTP. I risultati mostrano che tutti i dNTP canonici sono in grado di legarsi al sito AS2 e al sito catalitico. Nel caso degli analoghi nucleotidici, la clofarabina trifosfato è un attivatore AS2 e un substrato, mentre la citarabina trifosfato è in grado di occupare solo il sito catalitico. D'altra parte, non è stata osservata alcuna attività con la gemcitabina trifosfato, suggerendo che nelle condizioni testate la gemcitabina trifosfato non è in grado di agire come effettore allosterico né come substrato. Sebbene questo risultato sia coerente con le precedenti predizioni⁹, successivi studi di cristallizzazione e cinetica¹⁰ hanno rivelato che la gemcitabina trifosfato è in grado di legare la tasca catalitica SAMHD1 e che è effettivamente un substrato dell'enzima. Tuttavia, in quest'ultimo studio¹⁰, gli autori mostrano che il tasso di idrolisi è considerevolmente inferiore rispetto ad altri substrati riportati, come la citarabina trifosfato, spiegando così perché non siamo stati in grado di osservarlo con questa configurazione di screening.

Nel complesso, questi risultati rappresentativi convalidano l'uso del saggio di attività SAMHD1 accoppiato enzimatico come tecnica robusta per l'identificazione e la caratterizzazione di inibitori SAMHD1, regolatori allosterici e substrati. Tuttavia, come tutti gli approcci sperimentali, questo metodo ha le sue avvertenze, e quindi i saggi ortogonali (ad esempio, utilizzando una tecnologia di analisi diversa) dovrebbero essere utilizzati per convalidare ulteriormente i risultati.

Figura 1: Panoramica schematica del protocollo descritto in questo articolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Saggio di attività SAMHD1 accoppiato ad enzimi. (A) Curva standard Na₃PO₄ nel saggio del verde malachite. La diluizione seriale di Na₃PO₄ (2 volte) è stata preparata da 1 mM a 0,004 mM in triplice copia e incubata con reagente verde di malachite per 20 minuti. I valori grezzi di assorbanza sull'intero intervallo di concentrazioni testate sono mostrati nel pannello di sinistra e l'intervallo lineare nel pannello di destra. Rappresentativo di due esperimenti indipendenti mostrati. (B) Validazione del saggio di attività accoppiata enzimatica. SAMHD1 (0,35 μM) e/o PPasi (12,5 U/mL) in presenza o assenza di dGTP attivatore/substrato (25 μM) sono stati incubati per 20 minuti nel saggio di attività accoppiata enzimatica. Le quadruplette di un rappresentante di due esperimenti indipendenti mostrate con i valori grezzi di assorbanza tracciati, le barre e le barre di errore indicano la media e la DS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione dei composti per l'inibizione di SAMHD1 nel saggio di attività accoppiata enzimatica. Dose-risposta di lomofungina (0,78-100 μM), 2'-deossitimidina-5'-[(α,β)-imido]trifosfato (dTMPNPP, 0,01-100 μM) e deossiguanosina (dGuo, 10-1.500 μM) (A) o idrossiurea (HU) (0,78-100 μM) (B) nel saggio di attività SAMHD1 accoppiato enzimatico con dGTP (25 μM) come attivatore/substrato. Rappresentazione grafica dell'attività percentuale relativa ai controlli di reazione delle singole repliche (DMSO + SAMHD1/PPasi + dGTP = 100% di attività, DMSO + dGTP = 0% di attività) con un rappresentante di tre esperimenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Valutazione di analoghi nucleotidici come attivatori allosterici e substrati SAMHD1 nel saggio di attività accoppiata enzimatica. I nucleotidi canonici e i metaboliti trifosfati selezionati dei farmaci antitumorali citarabina (ara-CTP), clofarabina (Cl-F-ara-ATP) e gemcitabina (dF-dCTP) sono stati testati a 200 μM nel test di attività SAMHD1 accoppiato enzimatico in presenza o assenza di GTP o dGTPαS analogo dGTP non idrolizzabile (12,5 μM). Sono indicati i valori di assorbanza normalizzati delle singole repliche sperimentali tracciati, la media e la SD. Rappresentativo di due esperimenti indipendenti mostrati, adattati dal nostro precedente studio⁷. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Passo	Reagente	Volume erogato (μL)	Volume di reazione finale (μL)	Concentrazione erogata	Diluizione della piega in reazione	Concentrazione finale in reazione
1	Inibitore	5	20	0,4 mM	4	0,1 millimetri
2	SAMHD1+PPasi miscela	5		1,4 μM SAMHD1, 50 U/mL PPasi	4	0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/mL Ppasi
3	dGTP	10		50 μM	2	25 μM
4	Incubazione per 20 minuti
5	Soluzione EDTA	20	40	7,9 milioni di millimetri	2	3,95 millimetri
6	Reagente MG	10	50	2,5 mM Verde malachite, 64,4 mM Molibdato di ammonio, 0,18% Tween-20	5	0,5 mM verde malachite, 12,9 mM molibdato di ammonio, 0,036% Tween-20
7	Incubazione per 20 minuti
8	Lettura @ 630 nm

Tabella 1: Riepilogo delle condizioni finali nel test accoppiato enzimatico per lo screening degli inibitori.

Passo	Reagente	Volume erogato (μL)	Volume di reazione finale (μL)	Concentrazione erogata	Diluizione della piega in reazione	Concentrazione finale in reazione
1	Regolatore allosterico	5	20	800 μM	4	200 μM
2	GTP o dGTPαS	5		50 μM	4	12,5 μM
3	SAMHD1 e/o PPasi	10		0,7 μM SAMHD1, 25 U/mL PPasi	2	0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/mL PPasi
4	Incubazione per 20 minuti
5	Soluzione EDTA	20	40	7,9 milioni di millimetri	2	3,95 millimetri
6	Reagente MG	10	50	2,5 mM Verde malachite, 64,4 mM Molibdato di ammonio, 0,18% Tween-20	5	0,5 mM verde malachite, 12,9 mM molibdato di ammonio, 0,036% Tween-20
7	Incubazione per 20 minuti
8	Lettura @ 630 nm

Tabella 2: Sintesi delle condizioni finali del test accoppiato enzimatico per lo screening dei regolatori allosterici

Discussione

Il saggio di attività accoppiata enzimatica qui descritto è un saggio colorimetrico ad alto rendimento che consente la misurazione indiretta dell'idrolisi del dNTP da parte di SAMHD1. Questo metodo sfrutta la capacità della PPasi inorganica di E. coli, che se inclusa in eccesso nella miscela di reazione, converte ogni trifosfato inorganico generato da SAMHD1 in tre singoli fosfati liberi che possono essere quantificati utilizzando il semplice ed economico reagente verde malachite. Forniamo questo test in un formato di piastra a 384 micropozzetti, ideale per lo screening di librerie di composti, e dimostriamo l'applicabilità e la versatilità di questa tecnica nell'identificazione e caratterizzazione di inibitori, attivatori e substrati di SAMHD1.

Come per tutti i saggi di screening biochimico in vitro , ci sono una serie di passaggi critici e considerazioni importanti, e molti di questi sono discussi in modo approfondito nel Manuale di guida per i saggi³⁹ disponibile gratuitamente. L'integrità degli enzimi ricombinanti purificati, sia SAMHD1 che dell'enzima accoppiato PPasi inorganica, è estremamente importante e deve essere confermata prima di stabilire il saggio. E di conseguenza, ogni nuova purificazione di questi enzimi dovrebbe essere soggetta a un certo livello di test per lotti, poiché le variabilità da lotto a lotto potrebbero introdurre incongruenze nei risultati. Idealmente, l'uso di un test diretto ortogonale, come l'HPLC, che consente la rilevazione sia del substrato che del prodotto di reazione, dovrebbe essere utilizzato per verificare l'attività della dNTP trifosfoidrolasi del ricombinante purificato SAMHD1 utilizzato.

Per quanto riguarda i limiti di questo saggio, il principale è che misura l'attività dNTPasica di SAMHD1 in modo indiretto, sfruttando l'attività della PPasi inorganica, che ha una serie di implicazioni. È importante confermare che la PPasi possiede poca o nessuna attività nei confronti dei nucleotidi utilizzati nel saggio e, allo stesso modo, che le piccole molecole inibitorie identificate non possiedono alcuna attività nei confronti della PPasi. Pertanto, per quanto riguarda lo screening, un contro-screening contro la PPasi può essere una considerazione importante. La presenza di PPasi nella reazione rende inoltre fondamentale l'utilizzo di un test ortogonale per confermare i risultati. Per quanto riguarda i saggi di attività diretta, ad oggi ne sono stati riportati alcuni, tra cui TLC ^9,20,23 e HPLC ^9,21, che rilevano con precisione l'esaurimento del substrato e la formazione di prodotti. Inoltre, il saggio^{b4NPP 21}, anch'esso ad alto rendimento, potrebbe essere utilizzato per testare potenziali inibitori; Tuttavia, non è l'ideale testare substrati o attivatori allosterici. Anche i saggi biofisici, come la fluorimetria a scansione differenziale (DSF), che abbiamo precedentemente riportato con SAMHD1¹⁸, possono essere particolarmente potenti nell'identificazione e caratterizzazione dei ligandi. Un'altra limitazione del saggio, in particolare come mostrato nella configurazione qui per l'identificazione di substrati e attivatori, è l'uso del dGTPαS analogico dGTP non idrolizzabile come attivatore AS1 e AS2. Mentre questo consente l'attivazione di SAMHD1 senza attività osservabile nel saggio, dGTPαS è un inibitore competitivo di SAMHD1 e quindi l'uso di alte concentrazioni inattiverà l'enzima. Man mano che la nostra comprensione di SAMHD1 progredisce, studi futuri potrebbero utilizzare molecole che occupano esclusivamente ogni sito di SAMHD1, negando così questo potenziale problema.

Come abbiamo mostrato qui, questo metodo è versatile e può essere utilizzato per affrontare una serie di domande biochimiche. Abbiamo descritto due varianti di questo saggio, una per l'identificazione di regolatori allosterici e substrati di SAMHD1, e un'altra per la caratterizzazione di inibitori, ma possono essere fatti ulteriori adattamenti. Per quanto riguarda i potenziali inibitori, questo saggio, essendo basato su piastre a micropozzetti, lo rende adatto per studi sul meccanismo d'azione a valle^39,40. Allo stesso modo, per un'ulteriore caratterizzazione dei substrati e dei regolatori allosterici, questa tecnica può essere utilizzata per determinare i parametri cinetici della catalisi, come abbiamo fatto per il metabolita attivo della citarabina e della clofarabina⁷. Tuttavia, uno svantaggio è che il saggio accoppiato enzimatico qui riportato è un test endpoint e quindi, sebbene adatto per lo screening, un test continuo sarebbe più adatto per alcuni studi meccanicistici. Arnold et al. hanno riportato un test enzimatico continuo che utilizza il biosensore MDCC-PBP⁶, che si basa sull'uso della proteina legante il fosfato periplasmatico (PBP) marcata con il fluoroforo cumarina maleimmide (MDCC) che può legarsi a un gruppo fosfato libero. MDCC-PBP è molto sensibile e consente la quantificazione di concentrazioni di fosfato molto basse, con un tempo di risposta del sensore compreso tra i millisecondi e i secondi.

SAMHD1 svolge una serie di importanti funzioni nella salute e nella malattia umana² , molte delle quali potrebbero essere collegate al suo ruolo centrale nel mantenimento dei livelli intracellulari di dNTP¹. Pertanto, l'identificazione di una sonda chimica di alta qualità verso l'attività della dNTPasi di SAMHD1 sarebbe un potente strumento nella definizione di questi legami e il saggio accoppiato enzimatico qui riportato potrebbe essere prontamente impiegato per identificare tali sonde. Inoltre, poiché i farmaci a base di nucleosidi, molti dei quali sono modulati da SAMHD1, costituiscono un gruppo diversificato e importante di^{terapie 41}; le sonde chimiche potrebbero essere ulteriormente sviluppate in farmaci per colpire SAMHD1 in ambito clinico, con l'obiettivo di migliorare l'efficacia di queste terapie. È inoltre fondamentale comprendere l'intera portata dell'interazione di questi composti a base di nucleosidi con SAMHD1, una questione che può essere affrontata utilizzando anche questo test accoppiato enzimatico. Nel complesso, il saggio di attività SAMHD1 accoppiato all'enzima, come riportato qui, è un test a basso costo, versatile e ad alto rendimento che può essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione di questo importante enzima.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP)	Jena bioscience	NU-1001	Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP)	Jena bioscience	NU-1002	Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS)	Jena bioscience	NU-424	Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay
2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP)	GE Healthcare	27-1870-04	SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay
2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP)	Jena bioscience	NU-907-1	Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP)	Jena bioscience	NU-1004	Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo)	Sigma-Aldrich	D0901	Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
384 well clear flat-bottom  microplate	Thermo Fisher Scientific	262160	Assay plate
96 well clear U-bottom polypropylene  microplate	Thermo Fisher Scientific	267245	Compound dilution plate
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A1343	Reagent required for malachite green working reagent
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP)	Jena bioscience	NU-1170	Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP)	Jena bioscience	NU-874	Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	VWR	23486.297	Solvent
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	EDTA stop solution component
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP)	Jena bioscience	NU-1607	Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay
GraphPad Prism	GraphPad Software	Prism 8	Data analysis and visualisation
Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G8877	Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay
His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase  (PPase)	Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet	-	Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green
His-tagged human SAMHD1	Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet	-	Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate
Hydroxyurea	Sigma-Aldrich	H8627	Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
Lomofungin	National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP)	NSC106995	Compound tested in SAMHD1 inhibition assay
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M2670	SAMHD1 reaction buffer component
Malachite green Carbinol hydrochloride	Sigma-Aldrich	213020	Malachite green stock component
Microplate Reader	Hidex	Hidex Sense Microplate reader	Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	31434	SAMHD1 reaction buffer component
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	567530	SAMHD1 reaction buffer component
Sodium phosphate (Na3PO4)	Sigma-Aldrich	342483	Required for phosphate standard curve
Sulphuric acid 95-97%	Sigma-Aldrich	84720	Malachite green stock component
Tris-Acetate salt	Sigma-Aldrich	T1258	SAMHD1 reaction buffer component
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706	SAMHD1 reaction buffer component
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component