Sistema di rilevamento del virus del DNA basato su RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e Deep Learning

Riepilogo

Presentiamo un protocollo che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi con un sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA e costruisce una microscopia portatile per smartphone con una classificazione assistita dall'intelligenza artificiale per il rilevamento di virus a DNA point-of-care.

Abstract

Segnaliamo un sistema di rilevamento del DNA virus veloce, facile da implementare, altamente sensibile, specifico per la sequenza e point-of-care (POC), che combina l'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA) e il sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA. Il DNA bersaglio viene amplificato e riconosciuto separatamente da RPA e CRISPR/Cas12a, che innesca l'attività di scissione collaterale di Cas12a che slega un reporter di DNA marcato con fluoroforo e generalizza la fluorescenza. Per il rilevamento POC, la microscopia portatile per smartphone è progettata per acquisire immagini fluorescenti. Inoltre, all'interno del sistema vengono implementati modelli di deep learning per la classificazione binaria di campioni positivi o negativi, ottenendo un'elevata precisione. Il virus della rana 3 (FV3, generi Ranavirus, famiglia Iridoviridae) è stato testato come esempio per questo sistema di rilevamento POC del virus a DNA e i limiti di rilevamento (LoD) possono raggiungere 10 aM entro 40 minuti. Senza operatori qualificati e strumenti ingombranti, l'RPA-CRISPR/Cas12a-SPM portatile e miniaturizzato con classificazione assistita dall'intelligenza artificiale (AI) mostra un grande potenziale per il rilevamento del virus POC DNA e può aiutare a prevenire la diffusione di tali virus.

Introduzione

Negli ultimi anni si sono verificate frequentemente epidemie di malattie infettive causate da diversi virus, tra cui l'epidemia di malattia da virus Ebola (EVD) nel 2014¹ e nel 2018², la sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) nel 2015³, l'epidemia di malattia da virus Zika nel 2015⁴, la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)⁵ e il continuo vaiolo delle scimmie causato dal virus del vaiolo delle scimmie (MKPV) nel 2022⁶. Questi improvvisi focola....

Protocollo

1. Trattamento dei campioni

1. Prendiamo il Frog Virus 3 (FV3, generi Ranavirus, famiglia Iridoviridae), un virus a DNA a doppio filamento. Selezionare il gene del capside maggiore (mcp) come bersaglio per la rilevazione di FV3 poiché è altamente conservato e solitamente considerato come bersaglio per la rilevazione del ranavirus. La sequenza di destinazione selezionata è mostrata nella Tabella 1.
   NOTA: Frog Virus 3 è preso come esempio in questo protocollo.
2. Per la preparazione dei frammenti di DNA bersaglio, utilizzare frammenti di DNA del gene mcp di FV3 e del virus della necro....

Risultati

Questo metodo si concentra su un sistema di rilevamento veloce, facile da implementare, altamente sensibile e point-of-care (POC) per i virus a DNA. La progettazione di coppie di primer per la reazione RPA e la progettazione di crRNA per la reazione CRISPR/Cas12a sono due delle parti essenziali poiché influenzeranno l'efficienza della reazione RPA-CRISPR/Cas12a e influenzeranno la successiva rilevazione e classificazione.

In questo metodo, FV3 è considerato un esempio d.......

Discussione

Con questo metodo, sviluppiamo un sistema di rilevamento del virus a DNA veloce, facile da implementare, altamente sensibile, specifico per la sequenza e POC con l'assistenza dell'intelligenza artificiale. Dopo aver ottenuto i campioni, viene applicata RPA per amplificare la sequenza target, quindi CRISPR/Cas12a può riconoscere il DNA target e rilasciare fluorescenza, che amplia il segnale di rilevamento. La microscopia portatile per smartphone è costruita per acquisire immagini a fluorescenza e i modelli di deep learn.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x amplification	OLYMPUS	OPLN20X
532 nm green laser	Thorlabs	PL201	with 0.9 mW output power
535 nm cutoff wavelength	chrome	AT535
6x DNA loading buffer	Thermo scientific	R0611
96-well black microplate	Corning Incorporated	3603	Black with flat clear bottom
Aspherical lens	Lubang	N/A
Bandpass filter	SEMROCK	FF01-542/27-25
Bsu DNA Polymerase	ATG Biotechnology	M103	Large Fragment
crRNA	Sangon Biotech	N/A
DNA fragments	Sangon Biotech	N/A
Dichroic holders	Ruicage	N/A
Dichroic mirror	SEMROCK	FF555-Di03-25x36	with a cutoff wavelength of 535 nm
E.Z.N.A Gel Extraction Kit	Omega Biotek	D2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)	New England Biolabs (Beijing) LTD	M0653T
Filter holders	Ruicage	N/A
Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probes	Sangon Biotech	N/A	TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends
GP32	ATG Biotechnology	M104
ImageJ	Open-source	Version 1.53t 24	Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/
Microplate reader	SPARK, TECAN	N/A
Multi-Block thermal Cycler PCR instrument	LongGene	N/A
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Scientific	ND-2000
NEBuffer r2.1	New England Biolabs (Beijing) LTD	B6002S	10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer
Oxygen plasma treatment	Electro-Technic  Products	N/A
Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK)	Ebio	PINDBK -25mL
PCR primer pairs	Sangon Biotech	N/A
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
RPA primer pairs	Sangon Biotech	N/A
Smartphone	Huawei	Mate10
Translation stages	Ruicage	N/A
Transmitted neutral density filters	Thorlabs	ND40A
Triplet achromatic lenses	Thorlabs	TRH127-020-A
UvsX	ATG Biotechnology	M105
UvsY	ATG Biotechnology	M106