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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation mit einem CRISPR/Cas12a-System für den Spurennachweis von DNA-Viren kombiniert und eine tragbare Smartphone-Mikroskopie mit einer durch künstliche Intelligenz unterstützten Klassifizierung für den Point-of-Care-Nachweis von DNA-Viren entwickelt.

Zusammenfassung

Wir berichten über ein schnelles, einfach zu implementierendes, hochsensitives, sequenzspezifisches und Point-of-Care (POC) DNA-Virus-Nachweissystem, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und das CRISPR/Cas12a-System für den Spurennachweis von DNA-Viren kombiniert. Die Ziel-DNA wird durch RPA und CRISPR/Cas12a separat amplifiziert und erkannt, was die kollaterale Spaltungsaktivität von Cas12a auslöst, die einen mit Fluorophor-Quenchern markierten DNA-Reporter spaltet und die Fluoreszenz verallgemeinert. Für die POC-Erkennung ist die tragbare Smartphone-Mikroskopie für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern ausgelegt. Darüber hinaus werden Deep-Learning-Modelle für die binäre Klassifizierung positiver oder negativer Proben eingesetzt, die eine hohe Genauigkeit erreichen. Das Froschvirus 3 (FV3, Gattung Ranavirus, Familie Iridoviridae) wurde als Beispiel für dieses DNA-Virus-POC-Nachweissystem getestet, und die Nachweisgrenzen (LoD) können innerhalb von 40 Minuten 10 aM erreichen. Ohne geschulte Bediener und sperrige Instrumente zeigt das tragbare und miniaturisierte RPA-CRISPR/Cas12a-SPM mit künstlicher Intelligenz (KI) unterstützte Klassifizierung ein großes Potenzial für den Nachweis von POC-DNA-Viren und kann dazu beitragen, die Ausbreitung solcher Viren zu verhindern.

Einleitung

In den letzten Jahren kam es häufig zu Epidemien von Infektionskrankheiten, die durch verschiedene Viren verursacht wurden, darunter die Ebola-Virusvirus-Epidemie (EVD) in den Jahren 20141 und 20182, das Middle East Respiratory Syndrome (MERS) im Jahr 20153, die Zika-Virus-Epidemie im Jahr 20154, die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)5 verursacht wurde, und die anhaltenden Affenpocken, die durch das Affenpockenvirus (MKPV) verursacht wurden, im Jahr 20226. Diese plötzlichen Ausbrüche epidemischer Infektionskrankheiten verursachen eine große Zahl von Todesfällen und bringen enorme wirtschaftliche Verluste und soziale Unruhen mit sich. Ein schnelles und genaues Nachweissystem ist dringend erforderlich, um die Infektion schnell zu diagnostizieren und eine weitere Ausbreitung des Virus zu verhindern.

In jüngster Zeit haben geclusterte CRISPR-Proteine (Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine weltweite Aufmerksamkeit erregt und vielversprechende Ergebnisse beim Nachweis von Nukleinsäuren gezeigt 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Das CRISPR/Cas12a-Protein, das von CRISPR-RNA (crRNA) gesteuert wird, bindet an die Ziel-DNA und spaltet sie. Diese Aktivität führt zur Freisetzung von unspezifischer einzelsträngiger DNA (ssDNA), die als Trans-Spaltung bekannt ist, und kann verwendet werden, um das Nachweissignal für den Nukleinsäurenachweis zu verbessern. Einige traditionelle Nachweismethoden wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) sind kompliziert, zeitaufwändig und kostspielig für den Point-of-Care-Nachweis (POC). In unserer bisherigen Arbeit haben wir erfolgreich ein automatisiertes, integriertes und kostengünstiges Nachweissystem für das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) entwickelt, das auf der CRISPR/Cas12a-Technologie basiert. In diesem System erreichten wir eine Nachweisgrenze von 1 pM innerhalb eines Zeitrahmens von 2 Stunden, ohne dass eine Amplifikation erforderlich war. Das CRISPR/Cas12a-System und die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) werden kombiniert, um die Sensitivität und Spezifität für den Nachweis von DNA-Spuren zu verbessern. Im Vergleich zu anderen isothermen Amplifikationstechniken ist RPA einfach aufgebaut und bequem zu bedienen, da es eine kürzere Reaktionszeit ohne ausgeklügelte Temperaturkontrollgeräte hat.

Für den POC-Nachweis von Krankheitserregern werden Instrumente wie Smartphone-Mikroskopie (SPM), Handheld-Fluorimeter oder Lateral-Flow-Strips für die Ergebnisauslesungen 16,17,18 entwickelt. SPM erfasst Bilder über eine Kamera und lädt sie zur schnellen Datenanalyse in einige mobile Anwendungen hoch. Eine solche Mikroskopie stellt ein tragbares, kostengünstiges und miniaturisiertes Signalerfassungssystem mit hoher Empfindlichkeit her und hat Vorteile beim Nachweis von Krankheitserregern wie H5N1, dem Zika-Virus und SARS-CoV-2 gezeigt19,20. Daher bauen wir ein tragbares SPM, um die Fluoreszenzsignale abzufangen, die durch die RPA-CRISPR/Cas12a-Detektion des Ziel-DNA-Virus ausgelöst werden. Die ssDNA-Reportersonde, die einen Fluorophor und einen Quencher verbindet, wird gespalten, wenn CRISPR/Cas12a das Ziel-DNA-Virus erkennt, und die vom Fluorophor emittierte Fluoreszenz kann von SPM erfasst werden.

Im Vergleich zu der professionellen Software, die üblicherweise verwendet wird, um die Ergebnisinformationen aus den Fluoreszenzbildern von SPM21 zu erhalten, verwenden einige Experten maschinelles Lernen und Deep Learning, um die Konzentrationen der Virus-DNA zu quantifizieren, nachdem sie Fluoreszenzbildererhalten haben 22, was zeitaufwändiger ist. Wenn es um die Klassifizierung medizinischer Bilder geht, werden häufig herkömmliche neuronale Netze (CNNs) verwendet, um Merkmale aus den verpixelten Rohbildern auf End-to-End-Weise zu lernen 23,24,25,26. Beliebte CNN-basierte Deep-Learning-Modelle wie AlexNet, DenseNet-121 und EfficientNet-B7 wurden in diesem Bereich erfolgreich eingesetzt27,28. Die Beschaffung großer Datensätze in bestimmten Bereichen kann jedoch eine Herausforderung darstellen und erfordert Transferlernen29,30. Bei diesem Ansatz wird ein Deep-Learning-Modell mit einem großen Datensatz vortrainiert, und das vortrainierte Modell wird als Ausgangspunkt für eine neue Aufgabe mit einem kleinen Datensatz verwendet. Diese Technik kann den Bedarf an großen Datensätzen reduzieren, Überanpassung bekämpfen und die Trainingszeit verkürzen31. Hier verwenden wir Deep-Learning-Modelle mit Transfer-Learning für die binäre Klassifizierung der Fluoreszenzbilder der positiven und negativen Proben.

Bei dieser Methode kombinieren wir RPA und das CRISPR/Cas12a-System zur Spurendetektion von DNA-Viren. Die Ziel-DNA wird durch RPA und CRISPR/Cas12a separat amplifiziert und erkannt, was die kollaterale Spaltungsaktivität von Cas12a auslöst, die einen mit Fluorophor-Quenchern markierten DNA-Reporter spaltet und die Fluoreszenz verallgemeinert. Wir bauen ein tragbares SPM, um die Fluoreszenzbilder für die POC-Detektion aufzunehmen und entwickeln Deep-Learning-Modelle für die binäre Klassifizierung. Das Schema des gebauten POC-Erkennungssystems ist in Abbildung 1 dargestellt. Ohne geschickte Bediener und sperrige Instrumente zeigt das RPA-CRISPR/Cas12a-SPM mit künstlicher Intelligenz (KI) unterstützter Klassifizierung ein großes Potenzial für den Nachweis von POC-DNA-Viren.

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Abbildung 1: Das Schema des RPA-CRISPR/Cas12-SPM-Detektionssystems zusammen mit der KI-Klassifizierung für gesammelte Bilder. Die Nukleinsäuren tierischer Proben werden von PINDBK freigesetzt. Die Ziel-DNA des Virus wird durch das RPA-CRISPR/Cas12a-System amplifiziert und spezifisch erkannt. CRISPR/Cas12a bindet an crRNA und der Cas12a-crRNA-Komplex an die Ziel-DNA, was die kollaterale Spaltung von CRISPR/Cas12a auf den ssDNA-Reportersonden auslöst. Das Fluorophor auf dem Reporter wird freigesetzt und die Fluoreszenz wird von einem kommerzialisierten Platten-Reader oder dem von uns entwickelten SPM detektiert. Drei verschiedene Deep-Learning-Modelle, darunter AlexNet, DenseNet-121 und EfficientNet-B7 mit Transfer-Learning, werden zur Klassifizierung der Fluoreszenzbilder verwendet. Diese Zahl wird mit Genehmigung von Lei et al.35 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

1. Verarbeitung der Proben

  1. Nehmen wir das Froschvirus 3 (FV3, Gattung Ranavirus, Familie Iridoviridae), ein doppelsträngiges DNA-Virus. Wählen Sie das Major Capsid (mcp)-Gen als Ziel für den Nachweis von FV3, da es hochkonserviert ist und normalerweise als Ziel für den Ranavirus-Nachweis angesehen wird. Die ausgewählte Zielsequenz ist in Tabelle 1 dargestellt.
    HINWEIS: Frog Virus 3 wird in diesem Protokoll als Beispiel genommen.
  2. Verwenden Sie für die Vorbereitung der Ziel-DNA-Fragmente DNA-Fragmente des mcp-Gens von FV3 und dem Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus (ISKNV, ein weiteres Ranavirus).
    HINWEIS: In dieser Studie wurden die Ziel-DNA-Fragmente kommerziell von einem Unternehmen bezogen, das in der Materialtabelle aufgeführt ist. Sie gelten als Ziel und Kontrolle der anschließenden Detektion.
NameReihenfolge
FV3 MCPNTS: 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGGGGGCGTtcccaggtcg... 3' (240 bps)
TS: 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgccgaaagc... 3' (240 bps)
ISKNV MCPNTS: 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 bps)
TS: 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc... 3' (231 bps)

Tabelle 1: In dieser Methode ausgewählte Zielsequenz.

2. RPA-Reaktion

  1. Entwerfen und synthetisieren Sie die RPA-Primer-Paare für die Zielsequenz. Die Sequenzen von RPA-Primer-Paaren sind in Tabelle 2 beschrieben.
  2. Bereiten Sie den 5x RPA-Reaktionspuffer (Tabelle 3) und MgCl2 (100 mM) vor.
  3. Mischen Sie die vier wichtigsten RPA-Enzyme (UvsX, UvsY, GP32, Bsu-Protein) im 1x RPA-Reaktionspuffer zusammen mit den im Voraus entwickelten Primern, wie in Tabelle 4 beschrieben.
  4. Die Mischung gründlich einreiben.
  5. Fügen Sie 1 μl des in Schritt 1 erhaltenen Ziels für jede RPA-Reaktion hinzu und mischen Sie es erneut gründlich durch Vortex.
  6. Fügen Sie 7 μl MgCl2 (100 mM) hinzu, um die Reaktion zu starten. Das Endvolumen jeder RPA-Reaktion beträgt 50 μl.
  7. Führen Sie den Assay 30 Minuten lang bei 37 °C durch.
  8. Das RPA-Produkt kann einige Tage bei 4 °C gelagert werden. Wenn sich RPA-Produkte verschlechtern, sollten Sie sie so schnell wie möglich zur weiteren Erkennung verwenden, um bessere Diagnoseergebnisse zu erhalten.
  9. [Fakultativ] Führen Sie eine DNA-Gelelektrophorese durch.
    1. Nehmen Sie 5 μl RPA-Produkte heraus, fügen Sie ein entsprechendes Volumen von 6x DNA-Ladepuffer hinzu und führen Sie die DNA-Gelelektrophorese im Trisacetat-EDTA (TAE)-Puffer durch.
    2. Lassen Sie die Elektrophorese etwa 20 Minuten lang unter 120 V laufen, bis die Bänder des Ladepuffers den Boden des Gels erreichen.
    3. Bestimmen Sie, ob die Zielsequenz erfolgreich aus der Probe amplifiziert wurde, indem Sie die Größe der Banden der Probe mit den Banden des Markers vergleichen.
NameReihenfolge
RPA-Einführung FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA-Einführung RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tabelle 2: RPA-Primer, die bei dieser Methode verwendet werden.

BestandteilUrsprüngliche KonzentrationAddition
PEG 20.000-114 mg
ATPca. 100 mM125 μL
dNTPs25 mM48 μL
Tris-HCl1 Mio.125 μL
DVB-T1 Mio.125 μL
Phosphokreatin1 Mio.250 μL
Kreatinkinase10 μg/μL50 μL
ddH2Ω-277 μL
Gesamtvolumen-1 ml

Tabelle 3: Die Zusammensetzung des 5x RPA-Reaktionspuffers (pH 7,5).

BestandteilUrsprüngliche KonzentrationAddition
5x RPA-Reaktionspuffer-10 μL
UvsX-Eiweiß5 mg/ml2,6 μl
UvsY-Protein5 mg/ml0,9 μl
GP32-Eiweiß5 mg/ml2,54 μl
Bsu-Protein5 mg/ml0,88 μl
Vorwärts-Grundierung100 μM0,25 μl
Umgekehrte Grundierung100 μM0,25 μl
ddH2Ω-24,58 μl
Ziel-1 μL
*MgCl2ca. 100 mM7 μL
Gesamtvolumen50 μL
*MgCl2 muss zuletzt hinzugefügt werden, um die RPA-Reaktion zu initiieren.

Tabelle 4: Die Zusammensetzung der RPA-Reaktion.

3. CRISPR/Cas12a-Nachweis ohne SPM

  1. Verwenden Sie die crRNAs (Table of Materials) der Zielsequenz und die ssDNA-Reportersonde, die ein Fluorophor und einen Quencher für CRISPR/Cas12a verbindet. Hier ist Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) als Fluorophor an den 5'-Enden der ssDNA-Reportersonden und Black Hole Quencher-2 (BHQ2) als Quencher an den 3'-Enden verknüpft. Die detaillierte Sequenz von crRNA und ssDNA-Reporter ist in Tabelle 5 beschrieben.
  2. Bereiten Sie das Protein des Bakteriums Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a) mit 10x CRISPR/Cas12a-Reaktionspuffer vor.
  3. 1 μl RPA-Reaktionsprodukt aus Abschnitt 2 in 1x CRISPR/Cas12a-Reaktionspuffer mit LbCas12a-crRNA-Komplexen und 500 nM ssDNA-Reportersonde in einem 100 μl Reaktionsvolumen lösen.
  4. Lassen Sie die Mischung nach dem Mischen von LbCas12a und crRNA mindestens 5 Minuten ruhen, um einen funktionellen Komplex zu bilden. Nach der Inkubation werden dem Reaktionsgemisch weitere Komponenten zugesetzt und die gesamte Reaktion bei 37 °C durchgeführt. Das Endvolumen jeder CRISPR/Cas12a-Reaktion beträgt 100 μl. Die detaillierten Konzentrationen der einzelnen Komponenten in jeder CRISPR/Cas12a-Reaktion sind in Tabelle 6 beschrieben.
  5. Die 100 μl CRISPR/Cas12a-Nachweisreaktion bei 37 °C für 30 min durchführen.
  6. Untersuchen Sie die Fluoreszenzsignale konstant mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Anregungswellenlänge von 535 nm und einer Emissionswellenlänge von 595 nm mit einer Verstärkung von 60.
    HINWEIS: Die Detektion verschiedener Wellenlängen von Anregungs- und Emissionslicht hängt von der Wahl des Fluorophors und des Quenchers in den zuvor entwickelten ssDNA-Reportersonden ab.
  7. Teilen Sie für diese gesammelten Daten den Kontrollwert durch die Messung der positiven Proben, um alle Daten zu normalisieren, und integrieren Sie sie dann für eine t-Test-Analyse mit zwei Stichproben.
NameReihenfolge
LbCas12a crRNA für FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
ssDNA-Reporter/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabelle 5: Sequenzen von CRISPR/Cas12a crRNA und ssDNA-Reportern, die bei dieser Methode verwendet werden.

BestandteilUrsprüngliche KonzentrationAddition
NEBuffer r2.1-10 μL
Lba Cas12a (Cpf1)10 μM0,5 μl
crRNA10 μM0,625 μl
Warten Sie mindestens 5 Minuten, bis sich der LbCas12a/crRNA-Komplex verbindet.
DNA-Reporter100 μM0,5 μl
ddH2Ω-87,375 μL
Ziel-1 μL
Gesamtvolumen-100 μL

Tabelle 6: Die Zusammensetzung der CRISPR/Cas12a-Reaktion.

4. SPM-Einrichtung

  1. Stellen Sie für den Anregungspfad einen Laserstrahl so ein, dass er durch die ND-Filter (Neutral Density) geht, um die Laserintensität zu dämpfen.
  2. Erzeugen Sie einen kollimierten Strahl aus einer asphärischen Linse (im Folgenden als L1 bezeichnet) und reflektieren Sie ihn durch den dichroitischen Spiegel (DM).
  3. Richten Sie das Licht durch das Objektiv (20x) auf den Objektträger, wo die Probe platziert wird, um die Fluoreszenz der Probe zu beleuchten und anzuregen. Der Probentisch ermöglicht eine präzise Einstellung der Brennebene, indem der Strahl auf die hintere Brennebene des Objektivs gerichtet wird. Die oben genannten Schritte bilden den Anregungspfad des SPM-Instruments.
  4. Für den Emissionspfad ist eine externe Linse (im Folgenden als L2 bezeichnet) so zu positionieren, dass auf der anderen Seite des Objektivs ein Zwischenbild entsteht. Das Objektiv beleuchtet gleichzeitig die Probe und sammelt das Emissionssignal.
  5. Zeichnen Sie das Fluoreszenzsignal der Probe mit dem Smartphone auf, das am Ende des Emissionspfads platziert ist. Verwenden Sie eine stabile Halterung, um ein Schütteln zu vermeiden.
  6. Stellen Sie einen Bandpassfilter zwischen L1 und der Kamera des Smartphones ein, um das angeregte Licht herauszufiltern, während nur das von der Probe emittierte Licht die Kamera erreicht, wodurch die Detektion optimiert werden kann.
  7. Immobilisieren Sie das SPM-Setup auf einem Steckbrett für den portablen Einsatz.
    HINWEIS: Das Schema und das physikalische Erscheinungsbild des SPM-Geräts für die Fluoreszenzdetektion auf der Grundlage der RPA-CRISPR/Cas12a-Reaktion sind in Abbildung 2 dargestellt. Die CRISPR/Cas12a-Detektion erfolgt auf dem im nächsten Schritt beschriebenen vorbehandelten Objektträger.

figure-protocol-11904
Abbildung 2: Schematisches und physikalisches Erscheinungsbild des SPM-Geräts, das für die Fluoreszenzdetektion verwendet wird. (A) Das physikalische Erscheinungsbild des SPM-Geräts für die Fluoreszenzbilderfassung nach der RPA-CRISPR/Cas12a-Reaktion. (B) Schematische Darstellung des SPM-Geräts zur Fluoreszenzdetektion auf der Grundlage der RPA-CRISPR/Cas12a-Reaktion. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Lei et al.35 geändert (Bildposition und -farbe angepasst). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Behandlung des Objektträgers zur Detektion mit SPM

  1. Polydimethylsiloxan (PDMS) wird durch Mischen von Base und Härter im Verhältnis 10:1 hergestellt und anschließend auf einer Herdplatte bei 80 °C für 2 h gebacken.
  2. Behandeln Sie sowohl PDMS als auch den Objektträger (Länge: 75 mm; Höhe: 50 mm) 120 s lang mit Sauerstoffplasma behandeln, dann zusammendrücken.
  3. Das Glas/PDMS bei 95 °C 2 h backen; Es wird durch die Si-O-Si-Bindung dauerhaft abgedichtet. PDMS hat eine hohe Transparenz und keine Autofluoreszenz, was der SPM-Detektion förderlich ist. Die Behandlung des Objektträgers und des PMDS erfolgt nach He et al.32

6. CRISPR/Cas12a-Nachweis mit SPM

  1. Verwenden Sie die crRNAs (Table of Materials) der Zielsequenz und die ssDNA-Reportersonde, die ein Fluorophor und einen Quencher für CRISPR/Cas12a verbindet. Bei dieser Methode wird Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) als Fluorophor an den 5'-Enden der ssDNA-Reportersonden und Black Hole Quencher-2 (BHQ2) als Quencher an den 3'-Enden verknüpft. Die detaillierte Sequenz von crRNA und ssDNA-Reporter ist in Tabelle 5 beschrieben.
  2. Bereiten Sie das Protein des Bakteriums Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a) mit 10x CRISPR/Cas12a-Reaktionspuffer vor.
  3. 1 μl RPA-Reaktionsprodukt aus Abschnitt 2 in 1x CRISPR/Cas12a-Reaktionspuffer mit LbCas12a-crRNA-Komplexen und 500 nM ssDNA-Reportersonde in einem 100 μl Reaktionsvolumen lösen.
  4. Lassen Sie die Mischung nach dem Mischen von LbCas12a und crRNA mindestens 5 Minuten ruhen, um einen funktionellen Komplex zu bilden. Nach der Inkubation werden dem Reaktionsgemisch weitere Komponenten zugesetzt und die Reaktion bei 37 °C abgeschlossen. Das Endvolumen jeder CRISPR/Cas12a-Reaktion beträgt 100 μl. Die detaillierten Konzentrationen der einzelnen Komponenten in jeder CRISPR/Cas12a-Reaktion sind in Tabelle 6 beschrieben.
  5. Führen Sie die 100 μl CRISPR/Cas12a-Nachweisreaktion auf dem vorbehandelten Objektträger durch und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Inkubieren Sie den Objektträger mit Reaktion bei RT für 10 min.
  6. Messen Sie die Fluoreszenzsignale mit dem SPM. Legen Sie den Objektträger mit der Detektionsreaktion auf den Tisch des SPM, halten Sie einen angemessenen Abstand ein, stellen Sie die Brennweite und Klarheit ein, suchen Sie dann nach dem Sichtfeld der Reaktion und fokussieren Sie es, um ein Bild aufzunehmen.
    HINWEIS: Zuerst sollte eine Standardkurve erstellt werden, damit die Daten aus den Proben auf den ungefähren Konzentrationsbereich skaliert werden können. Es werden verschiedene Konzentrationen von gereinigten Zielmolekülen verwendet, darunter 10 nM, 1 nM, 100 pM und 10 pM, ein weiteres Virus als Negativkontrolle (vor RPA).

7. Datensatz- und Datenerweiterung

  1. Sammeln Sie die Fluoreszenzbilder aus dem Detektionsassay in Abschnitt 6 als Datensätze. Wiederholen Sie mindestens drei parallele Erkennungen für jede Stichprobe, um die Datenparallelität sicherzustellen.
    1. Einige geeignete Wege zur Erreichung einer höheren Parallelität können genehmigt werden. Wenn Sie beispielsweise die Fluoreszenzbilder von jeder Probe sammeln, fokussieren Sie manuell und suchen Sie nach einem relativ helleren Feld, um Bilder aufzunehmen. Fotografieren Sie gleichzeitig jede Probe, um das Fluoreszenzsignal an mehr als fünf verschiedenen Stellen zu erhalten.
  2. Messen Sie den mittleren Grauwert jedes Bildes und die Standardabweichung des mittleren Grauwerts in einer Konzentrationsgruppe mit ImageJ.
  3. Legen Sie einen Intensitätsbereich [Median - Standardabweichung, Median + Standardabweichung] für die Datenbereinigung fest.
    HINWEIS: In den Bildern, die in den ersten Schritten erhalten wurden, kann es Bilder mit großen Unterschieden geben, so dass es notwendig ist, die Bilder zu überprüfen. Wenn die Intensitäten der Bilder außerhalb des festgelegten Schwellenwerts liegen, sollten sie als Ausreißer betrachtet und ausgeschlossen werden.
  4. Beschriften Sie die Bilder für das gereinigte Ziel bei steigenden Konzentrationen mit 0-6 in aufsteigender Reihenfolge.
  5. Um die Robustheit des Systems zu verbessern und eine Überanpassung zu verhindern, implementieren Sie Bilderweiterungstechniken wie horizontales Drehen, vertikales Spiegeln und zufälliges Rauschen durch Transformationsfunktionen in Python. Dies hilft, Variationen im Datensatz einzuführen.

8. Lernen übertragen

  1. Verwenden Sie als Backbone-Netzwerk das Deep-Learning-Modell AlexNet33 für die Klassifizierung.
  2. Um die Einschränkung des vortrainierten Modells in Abschnitt 7 zu erfüllen, formen Sie die Eingabebilder mithilfe von Transformationsfunktionen in Python auf 224 Pixel x 224 Pixel x 3 Kanäle (Höhe und Breite von 224 Pixeln und eine Tiefe von 3 Kanälen für die Farbkanäle Rot, Grün und Blau) um.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist eine gängige Vorverarbeitung für heterogene Daten im Transferlernen, einschließlich Transformieren.
  3. Verwenden Sie ein vortrainiertes Backbone-Netzwerk mit dem ImageNet-Dataset, um Features zu extrahieren und gleichzeitig die Gewichtungen der zwischengeschalteten verborgenen Schichten zu nutzen, die Sie gelernt haben.
  4. Ersetzen Sie im Auftragskontext für die Fluoreszenzklassifizierung die letzte vollständig verbundene Schicht des neuronalen Netzwerks, die ursprünglich 1000 Neuronen für die ImageNet-Aufgabe umfasste, durch eine vollständig verbundene Schicht mit 2 oder 7 Neuronen.
  5. Bewerten Sie die Leistung des Setup-Trainingsmodells mithilfe einer Reihe von Metriken, darunter Konfusionsmatrix, Genauigkeit, Präzision, Abruf und F1-Punktzahl basierend auf Lawton und Viriri34.

Ergebnisse

Diese Methode konzentriert sich auf ein schnelles, einfach zu implementierendes, hochsensitives und Point-of-Care (POC) Nachweissystem für DNA-Viren. Das Design der Primerpaare für die RPA-Reaktion und das crRNA-Design für die CRISPR/Cas12a-Reaktion sind zwei der wesentlichen Teile, da sie die Effizienz der RPA-CRISPR/Cas12a-Reaktion beeinflussen und den anschließenden Nachweis und die Klassifizierung beeinflussen.

Bei dieser Methode gilt FV3 als Beispiel für den Nac...

Diskussion

Bei dieser Methode entwickeln wir mit KI-Unterstützung ein schnelles, einfach zu implementierendes, hochsensitives, sequenzspezifisches und POC-DNA-Virusnachweissystem. Nach der Entnahme von Proben wird RPA angewendet, um die Zielsequenz zu amplifizieren, und dann kann CRISPR/Cas12a die Ziel-DNA erkennen und Fluoreszenz freisetzen, die das Detektionssignal vergrößert. Die tragbare Smartphone-Mikroskopie ist für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern ausgelegt, und Deep-Learning-Modelle mit Transferlernen werden für die...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China 31970752, Science, Technology, Innovation Commission of Shenzhen Municipality JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Offene Finanzierung des Shenzhen Bay Laboratory, SZBL2020090501004; Stiftung für Postdoktorandenwissenschaften in China 2020M680023; und Allgemeine Zollverwaltung der Volksrepublik China 2021HK007.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
20x amplificationOLYMPUSOPLN20X
532 nm green laserThorlabsPL201with 0.9 mW output power
535 nm cutoff wavelengthchromeAT535
6x DNA loading bufferThermo scientificR0611
96-well black microplateCorning Incorporated3603Black with flat clear bottom
Aspherical lensLubangN/A
Bandpass filterSEMROCKFF01-542/27-25
Bsu DNA PolymeraseATG BiotechnologyM103Large Fragment
crRNASangon BiotechN/A
DNA fragmentsSangon BiotechN/A
Dichroic holdersRuicageN/A
Dichroic mirrorSEMROCKFF555-Di03-25x36with a cutoff wavelength of 535 nm
E.Z.N.A Gel Extraction KitOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
Filter holdersRuicageN/A
Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probesSangon BiotechN/ATAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJOpen-sourceVersion 1.53t 24Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/ 
Microplate readerSPARK, TECANN/A
Multi-Block thermal Cycler PCR instrumentLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometersThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer
Oxygen plasma treatment Electro-Technic  ProductsN/A
Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK)EbioPINDBK -25mL
PCR primer pairsSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA primer pairsSangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Translation stagesRuicageN/A
Transmitted neutral density filtersThorlabsND40A
Triplet achromatic lensesThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106

Referenzen

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