Un saggio di reazione a catena della polimerasi digitale a goccia validabile per la rilevazione di vettori virali adeno-associati negli studi di bioshedding delle lacrime

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la convalida di buone pratiche di laboratorio nella rilevazione conforme di vettori virali adeno-associati in lacrime umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale a supporto dello sviluppo clinico di vettori di terapia genica.

Abstract

L'uso di vettori virali per il trattamento di malattie genetiche è aumentato notevolmente negli ultimi anni, con oltre 2.000 studi registrati fino ad oggi. I vettori virali adeno-associati (AAV) hanno riscontrato particolare successo nel trattamento delle malattie correlate agli occhi, come esemplificato dall'approvazione di voretigene neparvovec-rzyl. Per portare nuove terapie sul mercato, le agenzie regolatorie in genere richiedono studi di bioshedding qualificati o convalidati per valutare il rilascio del vettore nell'ambiente. Tuttavia, nessuna linea guida ufficiale per lo sviluppo di saggi a base molecolare a supporto di tali studi di spargimento è stata rilasciata dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti, lasciando agli sviluppatori di determinare le migliori pratiche per se stessi. Lo scopo di questo protocollo è quello di presentare un protocollo validabile per la rilevazione di vettori AAV in lacrime umane mediante reazione a catena della polimerasi digitale a goccia (ddPCR) a supporto di studi clinici di bioshedding. Questo manoscritto discute gli attuali approcci industriali alla convalida dei saggi molecolari e dimostra che il metodo supera i criteri di accettazione del test target attualmente proposti nei white paper. Infine, vengono discussi i passaggi critici nell'esecuzione di qualsiasi test ddPCR, indipendentemente dall'applicazione.

Introduzione

Le definizioni di terapia genica variano, ma generalmente inducono un'alternanza permanente intenzionale e spesso prevista di una specifica sequenza di DNA del genoma cellulare per modificare o manipolare l'espressione di un gene o alterare le proprietà biologiche di una cellula vivente per uno scopo clinico ^1,2. I vettori virali sono sempre più utilizzati come veicoli per la terapia genica a causa della loro efficienza di trasduzione, con un rapporto che suggerisce che oltre il 70% degli attuali studi clinici di terapia genica utilizza vettori virali³. L'interesse per i vettori virali per la terapia genica è in costante aumento. Il Quarter 4 2022 Quarterly Data Report on the Gene, Cell, and RNA therapy dell'American Society of Gene and Cell Therapy ha riportato che nel 2022 la pipeline di terapia genica, cellulare e RNA dalla preclinica alla pre-registrazione è cresciuta del 7%, portando il numero totale di terapie in fase di sviluppo a 3.726, di cui 2.053 (55%) erano terapie geniche⁴. La Food and Drug Administration degli Stati Uniti (USA FDA) ha attualmente approvato 27 terapie cellulari e geniche per uso clinico negli esseri umani, cinque delle quali utilizzano specificamente vettori virali⁵.

I virus adeno-associati (AAV) hanno guadagnato un interesse specifico come veicoli per la terapia genica. Una recente meta-analisi ha rivelato che ci sono stati circa 136 studi clinici che hanno studiato l'uso di AAV negli ultimi due decenni⁶. Inoltre, tre delle cinque terapie geniche approvate dalla FDA USA sono basate su AAV. Ciò è dovuto alla loro natura altamente modificabile, all'ampia gamma di ospiti che possono essere regolati in base all'uso di specifici vettori naturali o artificiali, alla bassa patogenicità e tossicità nell'uomo e generalmente alla bassa immunogenicità ^7,8. Gli AAV sono stati anche utilizzati con successo per trattare le malattie oculari in un ambiente clinico approvato. Voretigene neparvovec-rzyl è una terapia a base di AAV2 approvata dalla FDA statunitense nel 2017 e dall'Agenzia europea per i medicinali (EMA) nel 2018 per il trattamento della distrofia retinica associata alla mutazione biallelica RPE65 ⁹.

Con il crescente interesse per lo sviluppo di terapie basate su AAV arriva la necessità di linee guida normative sui saggi. Il rilevamento e la quantificazione accurati di qualsiasi vettore virale sono parte integrante delle fasi di scoperta, produzione e test preclinico/clinico dello sviluppo del prodotto. La FDA statunitense ha iniziato a pubblicare alcune linee guida per le terapie geniche, tra cui la chimica, la produzione e il controllo per le applicazioni sperimentali di nuovi farmaci per la terapia genica umana¹⁰, il follow-up a lungo termine dopo la somministrazione della terapia genica 11, i test retrovirus competenti per la replicazione 12 e le raccomandazioni per i vettori microbici utilizzati nelle terapie geniche ¹³. L'EMA ha anche pubblicato una serie di linee guida riguardanti lo sviluppo di prodotti di terapia genica che generalmente si allineano con le raccomandazioni della FDA, sebbene esistano alcune differenze¹⁴. È importante notare che, sebbene queste linee guida non stabiliscano responsabilità legalmente applicabili, tranne quando si fa riferimento a normative specifiche, forniscono chiarezza sull'attuale pensiero delle agenzie di regolamentazione sull'argomento e le loro aspettative per i test richiesti per i depositi di farmaci e l'approvazione normativa.

La FDA raccomanda specificamente che siano condotti studi per valutare la distribuzione, la persistenza e la clearance di un vettore dal sito di somministrazione per colpire i tessuti oculari e non oculari, i fluidi intraoculari e il sangue¹⁵. Questi assumono la forma di studi di biodistribuzione e spargimento. Gli studi di biodistribuzione valutano l'esposizione studiando come un prodotto si diffonde in tutto il corpo di un paziente dal sito di somministrazione. Lo spargimento valuta specificamente il rilascio del prodotto dal paziente nell'ambiente e aumenta la possibilità di trasmissione del vettore a individui non trattati¹⁶. La FDA formula raccomandazioni per la progettazione di studi di biodistribuzione e spargimento per quanto riguarda la frequenza della raccolta dei campioni, la durata della raccolta dei campioni, i tipi di campioni raccolti e le condizioni di conservazione.

Inoltre, la FDA raccomanda l'uso della reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR o real-time PCR) per la rilevazione quantitativa dei genomi vettoriali grazie alla sua facilità di prestazioni, al formato ad alta produttività, ai rapidi tempi di consegna e alla sensibilità del test. Tuttavia, vi è una relativa mancanza di raccomandazioni per la progettazione e la valutazione delle prestazioni dei metodi molecolari rispetto a quelli esistenti per le molecole piccole e grandi. Molte delle linee guida per tali studi sono difficili da applicare ai metodi molecolari a causa della progettazione unica e complessa sia dei prodotti che dei saggi stessi, sollevando dubbi sull'adeguatezza delle piattaforme disponibili per le valutazioni raccomandate e dei metodi appropriati per la convalida dei saggi. Ad oggi, la FDA non ha richiesto la convalida formale dei test basati sulla PCR, sebbene l'EMA abbia imposto questo requisito¹⁷. Alla luce di questo vuoto, diversi gruppi e workshop hanno pubblicato white paper e raccomandazioni che i produttori e le organizzazioni di ricerca a contratto hanno cercato di seguire 18,19,20,21,22,23,24,25. La maggior parte di queste raccomandazioni sono scritte specificamente con saggi qPCR in mente, con suggerimenti o modifiche per piattaforme emergenti, come droplet digital PCR (ddPCR), inclusi solo se ritenuto rilevante. Le raccomandazioni più recenti si sono concentrate sulle considerazioni per i saggi ddPCR, ma si sono in gran parte concentrate sulle loro applicazioni alla quantificazione del genoma vettoriale in un ambiente di produzione piuttosto che nelle complesse matrici biologiche incontrate negli studi di bioshedding.

A seconda dell'applicazione clinica e degli obiettivi, la ddPCR può essere preferita alla qPCR a supporto degli studi di biodistribuzione e spargimento a causa della maggiore sensibilità e capacità di gestire l'interferenza della matrice rispetto alla qPCR. Inoltre, grazie alla suddivisione dei campioni in circa 20.000 goccioline, è possibile ottenere una quantificazione accurata del numero di copie senza l'uso di una curva standard utilizzando la statistica di Poisson, semplificando lo sviluppo e la convalida del metodo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un approccio standardizzato per lo sviluppo e la validazione di un metodo basato su ddPCR per la rilevazione di vettori AAV in lacrime raccolte dalla superficie oculare a supporto di studi clinici di bioshedding.

Protocollo

1. Preparazione di un frammento di DNA sintetico

1. Progettare e ordinare un frammento di DNA sintetico contenente la regione di amplificazione target da utilizzare come controllo di qualità.
   1. Assicurarsi che la sequenza contenga l'intera sequenza di ampliconi dal primer in avanti al primer inverso del gene bersaglio di interesse, con un'estensione da quattro a sei coppie di basi di sequenza alle estremità 5' di ogni sequenza di legame del primer.
   2. Evitare omopolimeri di adenina e timina superiori a 12 paia di basi o coppie di basi guanina e citosina superiori a otto paia di basi, poiché gli omopolimeri possono interferire con la sintesi del frammento genico.
      NOTA: Se gli ampliconi contengono tali sequenze, le sostituzioni di base possono essere effettuate purché vengano mantenuti i siti di ricottura per i primer e le sonde.
   3. In alternativa, preparare un plasmide linearizzato contenente l'amplicone utilizzando strategie di clonazione tipiche.
2. Centrifugare il tubo contenente il frammento di DNA sintetico in una microcentrifuga per ~ 10 s per garantire che il materiale venga raccolto sul fondo del tubo.
3. Risospendere il frammento di DNA sintetico utilizzando tampone tris-EDTA (TE) a una concentrazione di 1,0 ×^{10 10} copie/μL o, se del caso, in base all'intervallo di analisi target.
4. Vortice brevemente, quindi incubare a 50 °C per 20 ± 5 min. Raffreddare sul ghiaccio.
5. Preparare aliquote multiple, idealmente monouso e conservare a -70-90 °C fino all'uso.
   NOTA: I frammenti di DNA sintetico preparati in questo modo sono generalmente stabili per almeno 24 mesi dalla data di risospensione.
6. Se lo si desidera, determinare l'esatta concentrazione dello stock di DNA sintetico preparato prima dell'uso come controllo di qualità o stimare la concentrazione nominale in base alla risospensione utilizzata.

2. Preparazione di primer e sonda

1. Progettare e ordinare primer e una sonda di idrolisi per indirizzare la regione di amplificazione desiderata utilizzando strategie di progettazione tipiche^26,27.
   1. Utilizzare un colorante reporter fluorescente da 5' (ad esempio, FAM) e un quencher da 3 '(ad esempio, quencher scuro nero dell'Iowa) compatibile con il sistema ddPCR.
      NOTA: Esistono numerosi pacchetti software per la progettazione di saggi PCR e possono essere utilizzati. Ad esempio, Primer-BLAST del National Center for Biotechnology Information²⁸ è ampiamente utilizzato grazie alle robuste opzioni per la progettazione del saggio e alla facilità con cui la specificità può essere valutata bioinformaticamente per identificare possibili effetti fuori bersaglio. Va notato che la preparazione di primer e sonde può variare dai passaggi elencati qui a seconda del formato in cui vengono forniti.
2. Centrifugare i tubi contenenti il primer anteriore, il primer inverso e la sonda in una microcentrifuga per ~ 10 s al materiale pellet sul fondo del tubo.
3. Risospendere i primer a 20 μM utilizzando il buffer TE. Vortice brevemente.
4. Risospendere la sonda a 10 μM utilizzando il buffer TE. Vortice brevemente.
5. Preparare aliquote multiple, idealmente monouso e conservare ad almeno -20 °C fino all'uso.
   NOTA: I primer e le sonde preparati in questo modo sono generalmente stabili per almeno 24 mesi dalla data di risospensione.

3. Preparazione del tampone di diluizione del campione

1. Tampone PCR di scongelamento e DNA di sperma di salmone tosato a temperatura ambiente. Vortice accuratamente per mescolare.
2. Preparare un tampone di diluizione del campione, come da Tabella 1.
3. Vortice a fondo. Conservare a 2-8 °C fino a 1 mese dopo la preparazione.

Tabella 1: Preparazione del tampone di diluizione del campione. Clicca qui per scaricare questa tabella.

4. Preparazione del master mix

1. Scongelare la miscela master ddPCR per sonde, primer in avanti, primer inverso e sonda a temperatura ambiente e lasciare riscaldare per almeno 10 minuti dopo lo scongelamento prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente fino all'uso.
   NOTA: Questi reagenti devono essere completamente portati a temperatura ambiente per garantire un'efficiente formazione di goccioline. Non tenere i reagenti sul ghiaccio durante la preparazione.
   1. Vortex accuratamente e brevemente centrifugare in una mini centrifuga prima dell'uso.
      NOTA: Gli enzimi di restrizione sono tipicamente forniti in glicerolo e devono essere rimossi dalla conservazione immediatamente prima dell'uso. Mescolare delicatamente. Non vortice.
2. Preparare un master mix PCR per ogni target di amplificazione. Vedere la Tabella 2 per una composizione suggerita della miscela principale PCR e modificare le concentrazioni di primer e sonde come richiesto.
   1. Accuratamente vortice e centrifugare brevemente prima dell'aggiunta dell'enzima di restrizione. Aggiungere l'enzima di restrizione e invertire per mescolare.
      NOTA: In questa fase, sono necessari 22 μL di reazione PCR per ottenere un volume finale di 40 μL di reazione PCR dopo la formazione di goccioline (costituito da 15 μL di master mix PCR, 5,0 μL di modello e 20 μL di olio per la generazione di goccioline).
3. Aggiungere 16,5 μL di miscela master a ciascun pozzetto secondo la mappa della piastra. Vedere la Figura 1 per una mappa delle piastre di esempio per l'accuratezza della convalida e l'esecuzione di precisione.
   1. Assicurarsi che una piastra contenga tre preparati indipendenti della serie di controllo qualità (QC), tre aliquote lacrimali endogene testate in modo indipendente, aumentate a un livello alto e basso e senza punte e tre controlli indipendenti senza modello (NTC).
   2. Variare la disposizione di questi pozzetti attraverso la piastra, dove il Set 1 viene caricato in ordine di concentrazione decrescente, il Set 2 viene caricato in ordine di concentrazione crescente e il Set 3 viene caricato in ordine casuale per valutare se ci sono effetti specifici della posizione della piastra.
   3. Disporre i campioni per riempire il maggior numero possibile di colonne e riempire i pozzetti inutilizzati all'interno di una colonna con buffer di controllo. Includere più lotti di controllo endogeni (ad esempio, più pozze di lacrime o lacrime raccolte da individui) nei pozzi rimanenti, se lo si desidera.
   4. Sigillare la piastra con pellicola adesiva trasparente. Tenere la piastra a temperatura ambiente durante la preparazione del modello. In alternativa, tenere la piastra per un massimo di 4 ore a 2-8 °C, ma riportarla a temperatura ambiente per almeno 10 minuti prima dell'aggiunta della dima.

Tabella 2: Esempio di preparazione della miscela master PCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura 1: Esempio di mappa delle piastre per l'accuratezza della convalida e la precisione dell'esecuzione. Abbreviazioni: ULQC = controllo di qualità del limite superiore; HQC = controllo di alta qualità; MQC = controllo qualità medio; LQC = basso controllo di qualità; LLQC = controllo di qualità del limite inferiore; NTC = nessun controllo modello. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

5. Preparazione dei CQ

1. Scongelare frammenti di DNA sintetico o plasmidi linearizzati a temperatura ambiente e lasciare riscaldare per almeno 10 minuti dopo lo scongelamento prima dell'uso. Portare i modelli a temperatura ambiente per garantire un'efficiente formazione di gocce.
   1. Conservare a temperatura ambiente fino all'uso. Vortex accuratamente e brevemente centrifugare in una mini centrifuga prima dell'uso.
2. Preparare le diluizioni QC utilizzando il tampone di diluizione del campione come diluente. Un esempio delle concentrazioni raccomandate per preparare un'accuratezza di convalida e una corsa di precisione è presentato nella Tabella 3.
   NOTA: dopo aver completato con successo le esecuzioni di accuratezza e precisione, su ogni piastra è necessario eseguire solo il controllo di alta qualità (HQC), il controllo di qualità media (MQC) e il controllo di bassa qualità (LQC). Per l'accuratezza e la precisione, sono incluse almeno tre diluizioni indipendenti dei QC per la valutazione dell'accuratezza e della precisione intra-test. Dopo l'accuratezza e la precisione, è necessario includere una sola serie di diluizioni.
3. Dopo la preparazione, conservare le diluizioni a temperatura ambiente fino ad aggiungerle alla piastra.
4. Conservare le diluizioni su ghiaccio o a 2-8 °C se necessario. Prima dell'uso successivo, lasciare che le diluizioni si riscaldino a temperatura ambiente per almeno 10 minuti prima dell'uso. Scartare i QC alla fine della giornata.

Tabella 3: Esempio di preparazione del controllo di qualità (QC) utilizzando frammenti sintetici di DNA a doppio filamento. Abbreviazioni: ULQC = controllo di qualità del limite superiore; HQC = controllo di alta qualità; MQC = controllo qualità medio; LQC = basso controllo di qualità; LLQC = controllo di qualità del limite inferiore; NTC = nessun controllo modello. Clicca qui per scaricare questa tabella.

6. Preparazione dei campioni

1. Scongelare i campioni di lacrime raccolti da uno studio clinico a temperatura ambiente fino allo scongelamento e lasciare riscaldare per almeno 10 minuti dopo lo scongelamento prima dell'uso.
   1. Conservare a temperatura ambiente fino all'uso. Vortex accuratamente e brevemente centrifugare in una microcentrifuga prima dell'uso.
2. Diluire i campioni di lacrime 1:10 (o superiore) utilizzando il tampone di diluizione del campione come diluente in provette PCR da 0,2 ml o strisce PCR a 8 pozzetti. Sigillare i tubi.
   NOTA: A seconda della concentrazione prevista del target nelle lacrime, potrebbe essere necessario diluire ulteriormente i campioni o testare più diluizioni di ciascun campione.
3. Riscaldare i campioni in un termociclatore a 95 °C per 10 minuti, quindi tenere a 4 °C per almeno 5 minuti per raffreddare. Utilizzare una velocità di rampa di 3 °C/s.
   NOTA: I campioni possono rimanere nel termociclatore a 4 °C fino all'uso nello stesso giorno o possono essere congelati a -70-90 °C per una conservazione più lunga. Questo passaggio serve a denaturare il capside vettore, rilasciando il genoma. Poiché i frammenti di DNA sintetico QC o plasmidi linearizzati sono a doppio filamento, non dovrebbero subire questa fase di riscaldamento.
4. Riportare i campioni dopo il raffreddamento a temperatura ambiente (o se congelati, scongelarli a temperatura ambiente) e lasciare riscaldare per almeno 10 minuti.
   NOTA: I campioni devono essere completamente portati a temperatura ambiente per garantire un'efficiente formazione di goccioline.

7. Aggiunta di modelli

1. Recuperare la piastra ddPCR contenente la miscela master. Vortice ogni campione o provetta di diluizione QC accuratamente e brevemente centrifugare per raccogliere il materiale.
2. Rimuovere la pellicola adesiva e aggiungere 5,5 μL di QC o campioni ai pozzetti appropriati della piastra a 96 pozzetti, come da mappa della piastra.
   NOTA: fare riferimento al passaggio 4.2.1 per la spiegazione dei volumi richiesti
3. Aggiungere 5,5 μL di tampone di diluizione del campione ai pozzetti NTC.
4. La generazione di goccioline richiede che tutti i pozzetti di una colonna abbiano un controllo di reazione o buffer. Se i pozzetti di una colonna non contengono reazioni del campione, diluire 2x controllo tampone ddPCR 1:2 usando acqua priva di nucleasi. Aggiungere 22 μL di 1x controllo buffer ddPCR a qualsiasi pozzetto vuoto di una colonna.
   Nota : se non viene utilizzata un'intera colonna, non è necessario aggiungere il controllo buffer a questi pozzetti.
5. Aggiungere un sigillo di alluminio perforabile al piatto. Posizionare la piastra nel sigillante e sigillare per 5 secondi a 180 °C.
   1. In alternativa, sigillare la piastra secondo le raccomandazioni del produttore del sistema ddPCR.
6. Vortice la piastra alla massima velocità per almeno 30 s (utilizzando l'impostazione del vortice continuo; non utilizzare il vortice a contatto) e centrifugare brevemente in un filatore a piastre.
   NOTA: La miscelazione accurata e completa della piastra in questa fase è fondamentale per una corretta ripartizione della reazione PCR in goccioline. Assicurarsi che non ci siano bolle visibili nei pozzi. Se necessario, la piastra può essere tenuta a 2-8 °C prima della generazione di goccioline per un massimo di 4 ore. Se tenuta, lasciare che la piastra raggiunga la temperatura ambiente per un minimo di 10 minuti prima della generazione di goccioline.

8. Generazione automatica di goccioline, cicli termici e lettura delle gocce

1. Generare goccioline nel generatore automatico di goccioline come segue.
   1. Sul touch screen, selezionare le colonne sulla mappa della lastra contenente i campioni. Il deck dello strumento si illuminerà per indicare quali materiali di consumo (cartucce DG32, punte, contenitore dei rifiuti, olio per la generazione di gocce) sono necessari. Le luci gialle indicano che è necessario aggiungere un materiale di consumo, mentre le luci verdi indicano che sono disponibili materiali di consumo sufficienti.
   2. Caricare il generatore di gocce da dietro a davanti.
   3. Per le sonde di idrolisi, assicurarsi che sia installato l'olio di generazione di goccioline per le sonde e che rimanga olio sufficiente per il numero di pozzi. Se vengono utilizzati prodotti chimici PCR alternativi, assicurarsi che sia installato un olio per la generazione di gocce compatibile.
   4. Posizionare un blocco freddo nel supporto della piastra a goccia. Assicurati che il blocco sia completamente di colore blu e che non sia visibile alcun rosa. Posizionare una nuova piastra ddPCR a 96 pozzetti nel blocco freddo.
   5. Posizionare la piastra PCR preparata nel supporto della piastra del campione. Chiudere il coperchio della macchina. Premere start per la generazione di goccioline.
2. Dopo la formazione di goccioline, un totale di 40 μL per reazione viene trasferito automaticamente alla nuova piastra PCR.
3. Entro 30 minuti dal completamento della generazione di goccioline, rimuovere la piastra contenente le goccioline dal blocco freddo. Lavora delicatamente poiché le goccioline sono più fragili in questa fase.
4. Aggiungere un sigillo di alluminio perforabile al piatto. Posizionare la piastra nel sigillante e sigillare per 5 secondi a 180 °C.
   1. In alternativa, sigillare la piastra secondo le raccomandazioni del produttore del sistema ddPCR.
5. Posizionare la piastra in un termociclatore compatibile. Inserire le condizioni di ciclismo (vedi tabella 4).
6. Dopo la fine del ciclo termico, tenere la piastra nel termociclatore, trasferita a 2-8 °C, o leggerla immediatamente.
   NOTA: Tenere la piastra per 12 ore a 4-12 °C può migliorare la conta delle goccioline, ma questo non è necessario. Goccioline sufficienti dovrebbero essere ottenute senza la presa.
7. Caricare la piastra nel lettore di gocce, assicurandosi che rimanga sufficiente olio per il lettore e che il contenitore dei rifiuti abbia spazio sufficiente. Leggi le goccioline. Eseguire la lettura delle goccioline entro 24 ore dall'inizio del ciclo termico.

Tabella 4: Condizioni tipiche del ciclo termico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

9. Analisi dei dati

NOTA: Un minimo di 10.000 goccioline per pozzetto è necessario per il corretto calcolo della concentrazione utilizzando la statistica di Poisson. Non tentare l'analisi su pozzi con meno di 10.000 goccioline.

1. È necessaria una soglia per definire le goccioline come positive o negative. Il software di analisi ddPCR applica automaticamente una soglia che può variare tra i pozzi. Tuttavia, impostare manualmente una soglia per tutti i pozzetti della piastra leggermente superiore all'intensità fluorescente dei pozzetti NTC per risultati più coerenti, accurati e precisi.
   NOTA: Il corretto posizionamento della soglia può richiedere un'ottimizzazione a seconda della separazione delle goccioline positive e negative e della quantità di pioggia di goccioline presente (vedere la Figura 2). In questo esempio, il grafico dell'ampiezza delle gocce mostra pozzetti di esempio a ciascun livello QC e NTC. La linea viola indica una soglia di 1.000, posta leggermente al di sopra della popolazione di goccioline negative.
2. La modellazione statistica di Poisson richiede almeno tre goccioline positive per calcolare la concentrazione con un'affidabilità del 95%. Considera tutti i pozzetti contenenti zero, una o due goccioline positive come negativi e impostati su una concentrazione di zero²⁷.
3. Calcola il numero di copie in ciascun campione di strappo.
   1. La concentrazione, in copie/μL, è fornita nel rapporto sui dati. Utilizzare questo valore per determinare la concentrazione in copie/μL del campione originale (cioè nel campione lacrimale).
   2. Per calcolare la diluizione della reazione ddPCR, dividere il volume iniziale della reazione PCR prima della formazione di goccioline per il volume di modello aggiunto. Quando vengono utilizzati i volumi presentati in questo metodo, si ottiene un valore pari a 4.
      
   3. Determinare il fattore di diluizione seriale dal campione originale (punto 6.2).
   4. Per determinare le copie/μL nel campione, moltiplicare le copie/μL per la diluizione della reazione ddPCR, quindi per il fattore di diluizione seriale. Ad esempio, la concentrazione in copie/μL generata nel rapporto sui dati era 966; Sono stati aggiunti 5,5 μL di modello per 22 μL di reazione. È stata utilizzata una diluizione seriale 1:50.000 del campione.
      
      
   5. Se sono state testate più diluizioni dello stesso campione, analizzare tutte le diluizioni valide nell'intervallo e calcolare la media.
4. Per ogni QC, calcolare le copie attese/μL di reazione PCR dividendo la concentrazione della diluizione QC data (in copie/μL) per il volume di reazione ddPCR (20 μL). Ciò consente il confronto diretto di questo valore nominale con il valore copie/μL fornito nel rapporto dati senza ulteriori calcoli.
   NOTA: Questo approccio è stato utilizzato anche per l'analisi dei campioni di lacrime a spillo utilizzati nei risultati rappresentativi.
5. Determinare il valore medio, la deviazione standard, il coefficiente di variazione (%CV) e l'errore relativo percentuale rispetto alla concentrazione nominale (%RE) del campione o del valore QC utilizzando i pozzetti replicati (includere più diluizioni se applicabile).
   1. Per la valutazione della precisione tra pozzetti, determinarla per ciascuno dei duplicati del pozzo, se inclusi.
   2. Per la valutazione dell'accuratezza e della precisione intra-test, determinarla per ciascuna serie di diluizione o aliquota utilizzata all'interno di un lotto.
   3. Per la valutazione dell'accuratezza e della precisione tra test, determinarla utilizzando i mezzi intra-test di ciascuno dei lotti inclusi.

Figura 2: Esempio di impostazione della soglia. Abbreviazioni: ULQC = controllo di qualità del limite superiore; HQC = controllo di alta qualità; MQC = controllo qualità medio; LQC = basso controllo di qualità; LLQC = controllo di qualità del limite inferiore; NTC = nessun controllo modello. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

10. Criteri di accettazione del saggio

1. Utilizzare le seguenti specifiche per i dati calcolati per ciascun lotto per determinare se il batch è accettabile. Se queste condizioni non sono soddisfatte, invalidare e ripetere il batch.
   NOTA: Questi criteri sono stati determinati come consenso dai white paper pubblicati sulla convalida dei saggi basati sulla PCR 18,19,20,21,22,23,24,25. Può essere necessario modificare i criteri obiettivo in base all'applicazione clinica.
2. Nessun controllo modello (NTC)
   1. Assicurarsi che ogni pozzo NTC abbia almeno 10.000 goccioline.
   2. Assicurarsi che ogni pozzo NTC abbia meno di 3 goccioline positive.
3. QC e gamma di test
   1. Assicurati che ogni pozzo QC abbia almeno 10.000 goccioline.
   2. Assicurarsi che la precisione dei pozzetti replicati di una concentrazione di controllo qualità sia ≤25,0% CV, tranne ai limiti superiore e inferiore della quantificazione, dove ≤30,0% è accettabile. Valutarlo in modo indipendente per ogni set di controllo qualità e livello di concentrazione.
   3. Assicurarsi che l'errore relativo della concentrazione retrocalcolata a ciascun livello medio di QC sia compreso tra ±25,0% RE della concentrazione nominale (copia / reazione PCR), tranne ai limiti superiore e inferiore della quantificazione, dove ±30,0% RE è accettabile. Valutarlo in modo indipendente per ogni set di controllo qualità e livello di concentrazione.
   4. Assicurati che almeno 2/3 dei campioni QC (ad esempio, quattro risultati su sei) e il 50% dei campioni QC a ciascun livello (basso, medio, alto) soddisfino queste linee guida.
4. Campioni
   1. Assicurarsi che i pozzetti campione da analizzare abbiano almeno 10.000 goccioline.
   2. Assicurarsi che la precisione dei pozzetti replicati di una diluizione del campione da analizzare sia ≤25,0% CV.
   3. Assicurarsi che almeno una diluizione inclusa del campione dato rientri nell'intervallo di quantificazione definito del test, come definito sopra in base ai QC limite superiore e inferiore.
   4. Se tutte le diluizioni includevano risultati di resa superiori al limite superiore definito di quantificazione e se rimane un volume sufficiente del campione, ripetere il saggio utilizzando una diluizione più elevata del campione.
   5. Se tutte le diluizioni incluse danno un risultato inferiore al limite inferiore di quantificazione e se rimane un volume sufficiente del campione, ripetere il saggio utilizzando una diluizione inferiore del campione.
      NOTA: I campioni contenenti più di tre goccioline positive, ma che hanno una concentrazione inferiore al limite inferiore di quantificazione, possono essere descritti come rilevabili, ma non quantificabili.

Discussione

Ci sono diversi passaggi del protocollo ddPCR che sono fondamentali per la corretta esecuzione del test. Il primo passo critico è la progettazione e l'ottimizzazione dei primer e della sonda. In generale, l'uso della chimica basata sulla sonda di idrolisi rispetto alla chimica a base di coloranti (ad esempio, SYBR Green) in un contesto preclinico o clinico è raccomandato a causa della loro specificità superiore. Inoltre, la scelta del target di amplificazione è critica. Tipicamente, il transgene di interesse del vettore è mirato. Tuttavia, in fasi precliniche precedenti o in vettori in cui potrebbe non essere possibile distinguere il transgene vettoriale rispetto al DNA genomico, può essere appropriato utilizzare bersagli vettoriali standardizzati. Ad esempio, si potrebbe prendere di mira la regione di ripetizione terminale invertita, il promotore, la coda poli-A o le giunzioni inter-segmento tra questi componenti vettoriali. La scelta del target varierà in base al design vettoriale. Le tradizionali strategie e software di progettazione di primer e sonda qPCR sono in genere appropriati per la ddPCR. I parametri di progettazione che dovrebbero produrre una temperatura di ricottura costante (ad esempio, 60 °C) devono essere selezionati per ridurre la quantità di ottimizzazione richiesta. È stato inoltre raccomandato di progettare, ordinare e valutare almeno tre diversi set per ciascun target. Si dovrebbe quindi selezionare il set che mostra la maggiore specificità (nessuna amplificazione nel pozzo di controllo negativo o in una matrice di DNA bersaglio correlato) e sensibilità (cioè limite di rilevazione)²⁰.

Se è vantaggioso essere in grado di trasferire il test tra qPCR e ddPCR, si raccomanda di ottimizzare prima le condizioni del test utilizzando qPCR e di identificare le condizioni per il set selezionato che si traducono in efficienze di amplificazione del 90% -110% con un R² ≥ 0,98. Tuttavia, la ddPCR come metodo endpoint è tipicamente meno sensibile della qPCR a causa delle variazioni nelle efficienze di amplificazione. Come minimo, si raccomanda di eseguire un gradiente di temperatura termica nella fase di ricottura/estensione per coprire temperature superiori e inferiori alle temperature di ricottura previste e di valutare la separazione dell'ampiezza della pioggia e della fluorescenza tra i cluster di goccioline negativi e positivi in funzione della temperatura. Se l'area di lavoro lo consente, si consiglia di disporre di singole workstation dedicate per la preparazione del master mix, l'aggiunta di modelli e l'amplificazione. Ove possibile, questi dovrebbero essere fisicamente separati da un flusso di lavoro unidirezionale con controlli tecnici integrati, come l'accesso controllato e le pressioni dell'aria differenziale, per ridurre il rischio di contaminazione incrociata e falsi positivi. Se ciò non è possibile, è necessario prestare estrema attenzione per prevenire la contaminazione incrociata.

Ci sono due passaggi in questo protocollo che possono sembrare insoliti per coloro che sono più abituati allo sviluppo del test qPCR. Il primo è l'inclusione di un enzima di restrizione nel master mix PCR. Durante l'amplificazione ddPCR, ogni goccia viene termociclizzata all'endpoint. In un test opportunamente ottimizzato, ciò si traduce in due popolazioni di goccioline, una serie che mostra un livello costantemente elevato di segnali fluorescenti - i positivi - e un altro che mostra costantemente un basso livello di segnale fluorescente - i negativi. Se si verifica un'interferenza PCR, può desincronizzare l'inizio dell'amplificazione PCR, con il risultato che la goccia non raggiunge un plateau di amplificazione e quindi endpoint fluorescenti incoerenti. In questo caso, le goccioline saranno distribuite tra negativi e positivi, risultando in un fenomeno chiamato pioggia ddPCR. Ciò può comportare una quantificazione imprecisa dell'obiettivo e soglie applicate in modo incoerente e soggettivo. La nostra raccomandazione di impostare la soglia leggermente al di sopra del segnale del NTC, che dovrebbe ridurre al minimo gli effetti della pioggia nella quantificazione finale poiché tutte le goccioline sono ancora considerate positive, anche se non completamente ciclizzate all'endpoint. Gli AAV hanno una struttura secondaria altamente complessa che, a seconda del target di amplificazione, può ridurre l'accessibilità ai primer e alle sonde, con conseguente interferenza PCR e quindi pioggia. L'inclusione dell'enzima di restrizione nella miscela principale fende questa struttura secondaria per aumentare l'accesso da parte dei primer e delle sonde, riducendo la pioggia, che può quindi migliorare l'accuratezza del test. Gli effetti dell'inclusione di un enzima di restrizione nella reazione ddPCR sono stati descritti in precedenza ^25,32. Qualsiasi enzima di restrizione può essere utilizzato, purché sia confermato che non taglia all'interno della regione di amplificazione target. Non sono necessari passaggi di predigestione o composizioni tampone alternative.

Il secondo passo insolito è la preparazione del campione lacrimale contenente AAV. In questo protocollo, è stato utilizzato un rapporto 1:10 (o superiore) di lacrime e successivamente il campione è stato riscaldato. Tipicamente, quando le lacrime vengono raccolte attraverso un tubo capillare, che è un metodo di raccolta ampiamente utilizzato, in media circa 10,0 μL possono essere raccolti³³. La diluizione aiuta a risolvere il volume limitato del campione e fornisce materiale sufficiente per i test dei pozzi duplicati. Mentre questo riduce il limite teorico di rilevazione, la robusta sensibilità della ddPCR dovrebbe comunque portare alla rilevazione di tutte le particelle vettoriali tranne un numero estremamente esiguo. Questo approccio crea inoltre un pozzo di "backup" se uno dovesse fallire inaspettatamente. In questo caso, o in caso di volume di campione insufficiente per far funzionare due pozzi, l'errore di Poisson potrebbe essere utilizzato per valutare la precisione. Inoltre, nei casi in cui la concentrazione è inferiore al limite di rilevamento, crea l'opportunità di unire i dati dei pozzi per determinare una concentrazione. È necessario liberare i vettori AAV dai capsidi virali per il rilevamento della ddPCR. Alcuni metodi per la quantificazione dell'AAV hanno incluso una fase di digestione della proteinasi K per rimuovere il capside virale^34,35,36. Tutti i sierotipi AAV presenti in natura hanno temperature di fusione pari o inferiori a circa 90 °C, con la maggior parte che scende al di sotto di 80 °C; Pertanto, questa sembra essere un'inclusione non necessaria³⁷. Il riscaldamento da solo sembra essere sufficiente per rilasciare DNA vettore.

Inoltre, la ddPCR è generalmente meno suscettibile agli inibitori della PCR che possono essere presenti in un campione che può influenzare un test qPCR. Se viene inclusa una specifica fase di isolamento del DNA, ciò richiederebbe anche una convalida specifica, che viene evitata in questo protocollo. I campioni vengono diluiti prima del riscaldamento a causa della cinetica di diffusione dei genomi vettori in un liquido. Durante il processo di riscaldamento e successivo raffreddamento, i filamenti di senso positivi e negativi del genoma del DNA a singolo filamento possono ricottura insieme per produrre un intermedio a doppio filamento se le concentrazioni sono sufficientemente elevate. La diluizione prima del riscaldamento riduce le concentrazioni e rende matematicamente improbabile che si formino abbastanza intermedi a doppio filamento da avere un effetto negativo sull'accuratezza della quantificazione. Va notato che i frammenti di DNA sintetico o i plasmidi linearizzati utilizzati come controlli di qualità non devono essere sottoposti a questa fase di riscaldamento. Poiché si tratta di due filamenti, il riscaldamento comporterebbe la conversione in intermedi a singolo filamento. A seguito della suddivisione indipendente di questi QC a singolo filamento in goccioline, ciò dovrebbe comportare un aumento doppio della concentrazione di QC rispetto alla concentrazione nominale. In alternativa, se i QC devono essere riscaldati per standardizzare il metodo, questo deve essere preso in considerazione nella ricostituzione e nell'assegnazione di una concentrazione nominale.

Infine, per quanto riguarda la preparazione del campione, molti protocolli raccomandano anche l'inclusione di una fase di trattamento della DNasi per rimuovere qualsiasi DNA vettoriale non capsidata. Questo passaggio è fondamentale nei casi in cui non si desidera quantificare il DNA libero associato alla preparazione del vettore (come durante la quantificazione ai fini del dosaggio). Tuttavia, nel contesto degli studi di biodistribuzione e bioshedding, in genere si desidera sapere dove ha viaggiato il DNA di un vettore, indipendentemente dal fatto che sia incapsulato o meno. Pertanto, si suggerisce di non eseguire in genere una fase di trattamento della DNasi durante tali studi. Se si ritiene necessario includere una fase DNase, questa fase deve essere prima delle diluizioni e del riscaldamento.

In questo articolo vengono presentati dati rappresentativi dell'approccio alla valutazione della gamma dinamica, della sensibilità, dell'accuratezza e della precisione del metodo nel contesto di una convalida conforme alle buone pratiche di laboratorio adatte allo scopo. L'attuale mancanza di linee guida su questo argomento lascia che i laboratori di convalida determinino i criteri di analisi target per se stessi, in linea con l'attuale pensiero del settore. Diversi gruppi hanno posto criteri target sia più alti che più bassi rispetto a quelli utilizzati in questo studio 19,20,21,22,23,24,25. I criteri di analisi target, fino a quando non saranno definiti in modo più rigido, devono essere selezionati prima della convalida in base alle applicazioni cliniche previste del metodo. A seconda delle decisioni a valle da prendere sulla base dei dati, potrebbero essere necessari livelli più elevati di accuratezza e precisione. Al contrario, un semplice risultato positivo contro negativo può essere sufficiente.

L'approccio ha anche affrontato raccomandazioni per la valutazione della specificità e di un effetto matrice. Un pool di lacrime raccolte da individui non trattati non è riuscito a produrre un risultato positivo in questo test, mentre il bersaglio poteva essere rilevato quando il vettore è stato inserito nelle lacrime ad una concentrazione alta e bassa entro i tassi di recupero raccomandati. Idealmente, anche la matrice contenente vettore endogeno (ad esempio, raccolta dopo il trattamento con vettore virale) dovrebbe essere inclusa in queste valutazioni. Tuttavia, è improbabile che tali campioni siano disponibili per l'uso in una convalida. Per aumentare la robustezza della convalida, è stato possibile valutare più pool di lacrime, o lacrime raccolte da una varietà di individui, per determinare se si verifica un effetto della matrice specifico del paziente. Infine, si raccomanda di valutare la stabilità. Nei flussi di lavoro in cui l'estrazione del DNA avviene al di fuori della matrice biologica, può essere necessario valutare la stabilità sia del campione che del DNA estratto. In questo flusso di lavoro, il campione viene testato direttamente nel test senza la necessità di estrarre il DNA. Pertanto, in considerazione della valutazione della stabilità per questo metodo, è necessario valutare la stabilità dei campioni lacrimali. In genere, si raccomandano valutazioni di stabilità da banco, frigorifero, congelamento / disgelo e a lungo termine. Questi non sono stati eseguiti come parte di questo studio, ma i metodi sviluppati qui possono essere utilizzati in questa valutazione, a seguito di manipolazioni ai campioni di input.

Nel complesso, questo metodo ha dimostrato di essere un test robusto, ripetibile e validabile per rilevare vettori basati su AAV in campioni lacrimali. Può servire come piattaforma da adattare a vettori specifici per supportare le sperimentazioni cliniche e fornisce una base per la convalida di un test coerente con le buone pratiche di laboratorio.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV-eGFP Vector	Charles River Laboratories	RS-AAV2-FL	Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector
AutoDG Droplet Digital PCR system	Bio-Rad	QX200	Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
AutoDG Oil for Probes	Bio-Rad	1864110	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	1863004	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Piercable Foil Seals	Bio-Rad	1814040	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad	12001925	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023, 1863024, or 1863025	Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.
DG32 AutoDG Cartidges	Bio-Rad	1864108	Or use material compatible with ddPCR system.
Droplet Reader	Bio-Rad	QX200	Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
GeneAmp PCR Buffer	Applied Biosystems	N8080129	N/A
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9906	N/A
PCR Plate Sealer	Bio-Rad	PX1	Or use material compatible with ddPCR system.
Pipet Tips for AutoDG	Bio-Rad	1864120	Or use material compatible with ddPCR system.
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant	Gibco	24040	N/A
Primer and Hydrolysis Probes	Various	Various	Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.
Restriction Enzyme	Various	Various	Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence
Sheared salmon sperm DNA	ThermoFisher	AM9680	N/A
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid	Various	Various	Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control
TE Buffer	Teknova	T0224	Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0
Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	C1000	Or use material compatible with ddPCR system.