눈물의 바이오셰딩 연구에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 검출을 위한 검증 가능한 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 분석

요약

여기에서 우리는 유전자 치료 벡터의 임상 개발을 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응에 의한 인간 눈물에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 규정 준수 검출에 대한 우수 실험실 관행의 개발 및 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

유전 질환을 치료하기 위한 바이러스 벡터의 사용은 최근 몇 년 동안 크게 증가했으며 현재까지 2,000건 이상의 연구가 등록되었습니다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 voretigene neparvovec-rzyl의 승인에 의해 예시된 바와 같이 눈 관련 질병의 치료에서 특별한 성공을 발견했습니다. 새로운 치료법을 시장에 출시하기 위해 규제 기관은 일반적으로 벡터가 환경으로 방출되는 것을 평가하기 위해 적격하거나 검증된 바이오쉐딩 연구를 요청합니다. 그러나 미국 식품의약국(FDA)은 이러한 흘리기 연구를 지원하기 위한 분자 기반 분석 개발에 대한 공식 지침을 발표하지 않았으므로 개발자가 스스로 모범 사례를 결정해야 합니다. 이 프로토콜의 목적은 임상 바이오쉐딩 연구를 지원하기 위해 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)에 의해 인간 눈물에서 AAV 벡터를 검출하기 위한 검증 가능한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이 원고는 분자 분석 검증에 대한 현재 업계의 접근 방식에 대해 논의하고 이 방법이 현재 백서에서 제안된 표적 분석 허용 기준을 초과함을 보여줍니다. 마지막으로, 응용 분야에 관계없이 모든 ddPCR 분석의 성능에 중요한 단계에 대해 설명합니다.

서문

유전자 치료의 정의는 다양하지만, 일반적으로 유전자의 발현을 변형 또는 조작하거나 임상적 목적을 위해 살아있는 세포의 생물학적 특성을 변경하기 위해 세포 게놈의 특정 DNA 서열의 의도적이고 종종 예상되는 영구적인 교체를 유도한다 ^1,2. 바이러스 벡터는 형질도입의 효율성으로 인해 유전자 치료의 매개체로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 한 보고서에 따르면 현재 유전자 치료 임상 시험의 70% 이상이 바이러스 벡터를 활용한다고 합니다³. 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있습니다. 미국유전자세포치료학회(American Society of Gene and Cell Therapy)의 2022년 4분기 유전자, 세포 및 RNA 치료 환경에 대한 분기별 데이터 보고서에 따르면 2022년 전임상부터 사전 등록까지 유전자, 세포 및 RNA 치료 파이프라인이 7% 증가하여 개발 중인 총 치료법 수가 3,726개로 늘어났으며, 그 중 2,053개(55%)가 유전자 치료제였습니다⁴. 미국 식품의약국(FDA)은 현재 인간을 대상으로 한 임상용으로 27개의 세포 및 유전자 치료제를 승인했으며, 그 중 5개는 특히 바이러스 벡터를 활용한다⁵.

아데노 관련 바이러스(AAV)는 유전자 치료의 매개체로 특별한 관심을 받고 있습니다. 최근의 메타 분석에 따르면 지난 20 년 동안 AAV의 사용을 조사하는 약 136 건의 임상 시험이 있었다⁶. 또한 미국 FDA 승인 유전자 치료제 5개 중 3개는 AAV 기반입니다. 이는 편집 가능성이 높은 특성, 특정 자연 발생 또는 인공 조작 벡터의 사용에 따라 조정할 수 있는 광범위한 숙주 범위, 인간에서 낮은 병원성 및 독성, 일반적으로 낮은 면역원성 ^7,8 때문입니다. AAV는 또한 승인된 임상 환경에서 안구 질환을 치료하는 데 성공적으로 사용되었습니다. Voretigene neparvovec-rzyl은 2017년 미국 FDA와 2018년 EMA(European Medicines Agency)에서 이중대립유전자 RPE65 돌연변이 관련 망막 이영양증을 치료하기 위해 승인한 AAV2 기반 요법입니다⁹.

AAV 기반 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 분석에 대한 규제 지침이 필요합니다. 모든 바이러스 벡터의 정확한 검출 및 정량화는 제품 개발의 발견, 제조 및 전임상/임상 테스트 단계에서 필수적인 부분입니다. 미국 FDA는 인간 유전자 치료 연구용 신약 신청을 위한 화학, 제조 및 제어¹⁰, 유전자 치료 투여 후 장기 추적 관찰¹¹, 복제 적격 레트로바이러스 검사12, 유전자 치료에 사용되는 미생물 벡터에 대한 권장 사항¹³을 포함하여 유전자 치료에 대한 몇 가지 지침을 발표하기 시작했습니다. EMA는 또한 일반적으로 FDA 권장 사항에 부합하는 유전자 치료 제품 개발에 관한 일련의 지침을 발표했지만 몇 가지 차이점이 있습니다¹⁴. 이러한 지침은 특정 규정이 참조되는 경우를 제외하고 법적으로 집행 가능한 책임을 설정하지는 않지만 해당 주제에 대한 규제 기관의 현재 생각과 의약품 제출 및 규제 승인에 필요한 분석에 대한 기대치를 명확하게 제공한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

FDA는 특히 안구 및 비안구 조직, 안구내 및 혈액을 대상으로 투여 부위에서 벡터의 분포, 지속성 및 제거율을 평가하기 위한 연구를 수행할 것을 권장한다¹⁵. 이들은 생체 분포 및 흘리기 연구의 형태를 취합니다. 생체 분포 연구는 제품이 투여 부위에서 환자의 몸 전체에 어떻게 퍼지는지 조사하여 노출을 평가합니다. 쉐딩(Shedding)은 환자로부터 환경으로의 생성물의 방출을 구체적으로 평가하고, 치료받지 않은 개인에게 벡터가 전염될 가능성을 높인다⁽¹⁶). FDA는 샘플 수집 빈도, 샘플 수집 기간, 수집 된 샘플 유형 및 보관 조건과 관련하여 생체 분포 및 흘리기 연구 설계에 대한 권장 사항을 제시합니다.

또한 FDA는 성능 용이성, 고처리량 형식, 빠른 처리 시간 및 분석 민감성으로 인해 벡터 게놈의 정량적 검출을 위해 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR 또는 real-time PCR)을 사용할 것을 권장합니다. 그러나 소분자 및 대분자에 대해 존재하는 방법과 비교하여 분자 방법의 설계 및 성능 평가에 대한 권장 사항이 상대적으로 부족합니다. 이러한 연구에 대한 많은 지침은 제품과 분석 자체의 독특하고 복잡한 설계로 인해 분자 방법에 적용하기 어렵고, 권장 평가 및 분석 검증을 위한 적절한 방법에 사용할 수 있는 플랫폼의 적합성에 대한 의문을 제기합니다. 현재까지 FDA는 PCR 기반 분석에 대한 공식적인 검증을 요구하지 않았지만 EMA는 이 요구 사항을 부과했습니다¹⁷. 이러한 공백에 비추어 여러 그룹과 워크샵에서 제조업체와 계약 연구 기관이 18,19,20,21,22,23,24,25를 따르려고 노력한 백서와 권장 사항을 발표했습니다. 이러한 권장 사항의 대부분은 qPCR 분석을 염두에 두고 특별히 작성되었으며, 관련성이 있는 것으로 간주되는 경우에만 포함된 droplet digital PCR(ddPCR)과 같은 새로운 플랫폼에 대한 제안 또는 변경이 포함됩니다. 보다 최근의 권장 사항은 ddPCR 분석에 대한 고려 사항에 중점을 두었지만 바이오쉐딩 연구에서 발생하는 복잡한 생물학적 매트릭스보다는 제조 환경에서 벡터 게놈 정량화에 대한 적용에 주로 초점을 맞췄습니다.

임상 적용 및 목표에 따라 ddPCR은 qPCR에 비해 ddPCR의 향상된 감도와 매트릭스 간섭 처리 능력으로 인해 생체 분포 및 흘리기 연구를 지원하기 위해 qPCR보다 선호될 수 있습니다. 또한 시료를 약 20,000개의 액적으로 분할하기 때문에 포아송 통계를 사용하는 표준 곡선을 사용하지 않고도 복제 수를 정확하게 정량화할 수 있어 분석법 개발 및 검증이 간소화됩니다. 이 프로토콜의 목표는 임상 바이오셰딩 연구를 지원하기 위해 안구 표면에서 수집된 눈물에서 AAV 벡터를 검출하기 위한 ddPCR 기반 방법의 개발 및 검증을 위한 표준화된 접근 방식을 설명하는 것입니다.

프로토콜

1. 합성 DNA 단편의 제조

1. 품질 관리로 사용하기 위해 표적 증폭 영역을 포함하는 합성 DNA 단편을 설계하고 주문합니다.
   1. 서열에 관심 대상 유전자의 정방향 프라이머에서 역방향 프라이머까지의 전체 앰플리콘 서열이 포함되어 있는지 확인하고, 각 프라이머 결합 서열의 5' 말단에 4-6개의 염기쌍이 연장되어 있는지 확인합니다.
   2. 12 염기쌍보다 큰 아데닌 및 티민의 단독중합체 또는 8염기쌍보다 큰 구아닌 및 시토신 염기쌍은 긴 단독중합체가 유전자 단편의 합성을 방해할 수 있으므로 피하십시오.
      참고: amplicons에 이러한 서열이 포함되어 있는 경우 프라이머와 프로브의 어닐링 부위가 유지되는 한 염기 치환이 이루어질 수 있습니다.
   3. 대안적으로, 전형적인 클로닝 전략을 사용하여 앰플리콘을 함유하는 선형화된 플라스미드를 제조한다.
2. 합성 DNA 단편이 들어 있는 튜브를 ~10초 동안 미세 원심분리기에서 원심분리하여 튜브 바닥에 재료가 수집되도록 합니다.
3. tris-EDTA(TE) 버퍼를 사용하여 합성 DNA 단편을 1.0 ×¹⁰ copies/μL의 농도로 또는 표적 분석 범위에 따라 적절하게 재현탁합니다.
4. 잠시 소용돌이친 다음 50°C에서 20± 5분 동안 배양합니다. 얼음 위에서 식히십시오.
5. 이상적으로는 일회용 분취량을 여러 개 준비하고 사용할 때까지 -70 - -90 °C에서 보관하십시오.
   참고: 이러한 방식으로 제조된 합성 DNA 단편은 일반적으로 재현탁일로부터 최소 24개월 동안 안정적입니다.
6. 원하는 경우, 품질 관리로 사용하기 전에 준비된 합성 DNA 스톡의 정확한 농도를 결정하거나 사용된 재현탁액을 기준으로 공칭 농도를 추정합니다.

2. 프라이머 및 프로브의 제조

1. 프라이머 및 가수분해 프로브를 설계하고 주문하여 일반적인 설계 전략^26,27을 사용하여 원하는 증폭 영역을 표적화합니다.
   1. ddPCR 시스템과 호환되는 5' 형광 리포터 염료(예: FAM) 및 3' 소광제(예: Iowa Black dark quencher)를 활용합니다.
      참고: 수많은 PCR 분석 설계 소프트웨어 패키지가 존재하며 모든 패키지를 활용할 수 있습니다. 예를 들어, National Center for Biotechnology Information²⁸ 의 Primer-BLAST는 분석 설계를 위한 강력한 옵션과 가능한 오프 타겟 효과를 식별하기 위해 생물정보학적으로 특이성을 쉽게 평가할 수 있기 때문에 널리 사용됩니다. 프라이머 및 프로브의 준비는 제공되는 형식에 따라 여기에 나열된 단계와 다를 수 있습니다.
2. 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브가 들어 있는 튜브를 ~10초 동안 미세 원심분리기에서 원심분리하여 튜브 바닥에 재료를 펠릿으로 만듭니다.
3. TE 완충액을 사용하여 프라이머를 20μM로 재현탁합니다. 간단히 소용돌이.
4. TE 버퍼를 사용하여 프로브를 10μM로 재현탁합니다. 간단히 소용돌이.
5. 이상적으로는 일회용 분취액을 여러 개 준비하고 사용할 때까지 최소 -20°C에서 보관하십시오.
   참고: 이러한 방식으로 제조된 프라이머 및 프로브는 일반적으로 재현탁일로부터 최소 24개월 동안 안정적입니다.

3. 시료 희석 완충액의 제조

1. PCR 완충액과 전단된 연어 정자 DNA를 실온에서 해동합니다. 완전히 섞기 위해 소용돌이.
2. 표 1에 따라 샘플 희석 버퍼를 준비합니다.
3. 철저하게 소용돌이. 준비 후 최대 1개월 동안 2-8°C에서 보관하십시오.

표 1: 시료 희석 완충액의 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

4. 마스터 믹스의 제조

1. 프로브, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브용 ddPCR 마스터 믹스를 실온에서 해동하고 사용하기 전에 해동 후 최소 10분 동안 예열합니다. 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.
   참고: 이 시약은 효율적인 액적 형성을 위해 실온으로 완전히 가져와야 합니다. 준비하는 동안 얼음 위에 시약을 보관하지 마십시오.
   1. 사용하기 전에 미니 원심분리기에서 철저하고 짧게 원심분리하십시오.
      참고: 제한 효소는 일반적으로 글리세롤로 공급되며 사용 직전에 보관에서 제거해야 합니다. 부드럽게 섞는다. 소용돌이치지 마십시오.
2. 각 증폭 타겟에 대한 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 제안된 PCR 마스터 믹스 조성에 대해서는 표 2 를 참조하고 필요에 따라 프라이머 및 프로브의 농도를 수정합니다.
   1. 제한 효소를 첨가하기 전에 완전히 소용돌이 치고 간단히 원심 분리하십시오. 제한 효소를 넣고 뒤집어 섞습니다.
      참고: 이 단계에서는 액적 형성 후 PCR 반응 40μL의 최종 부피를 얻기 위해 22μL의 PCR 반응이 필요합니다(PCR 마스터 믹스 15μL, 템플릿 5.0μL 및 액적 생성 오일 20μL로 구성).
3. 플레이트 맵에 따라 각 웰에 16.5 μL의 마스터 믹스를 추가합니다. 그림 1 에서 검증 정확도 및 정밀도 실행에 대한 플레이트 맵의 예를 볼 수 있습니다.
   1. 플레이트에 품질 관리(QC) 시리즈의 3가지 독립적인 준비, 독립적으로 테스트된 3개의 내인성 눈물 분취량, 높은 수준과 낮은 수준으로 스파이크되고 스파이크되지 않은 3개, 3개의 독립적인 템플릿 없음 제어(NTC)가 포함되어 있는지 확인합니다.
   2. 플레이트 전체에 걸쳐 이러한 웰의 레이아웃을 변경하는데, 여기서 세트 1은 농도가 감소하는 순서로, 세트 2는 농도가 증가하는 순서로 로드되고, 세트 3은 플레이트 위치별 효과가 있는지 평가하기 위해 무작위 순서로 로드됩니다.
   3. 샘플을 배열하여 가능한 한 많은 열을 채우고 열 내의 사용되지 않는 웰을 제어 버퍼로 채웁니다. 원하는 경우 나머지 웰에 여러 내인성 대조군 로트(예: 더 많은 눈물 웅덩이 또는 개인으로부터 수집된 눈물)를 포함합니다.
   4. 투명 접착 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 템플릿을 준비하는 동안 플레이트를 실온에서 잡으십시오. 또는 플레이트를 2-8°C에서 최대 4시간 동안 유지하되 템플릿을 추가하기 전에 최소 10분 동안 실온으로 되돌립니다.

표 2: PCR 마스터 믹스 제조의 예. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1: 검증 정확도 및 정밀 실행을 위한 플레이트 맵의 예. 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. QC 준비

1. 합성 DNA 단편 또는 선형화된 플라스미드를 실온에서 해동하고 사용하기 전에 해동 후 최소 10분 동안 따뜻하게 합니다. 효율적인 액적 형성을 보장하기 위해 템플릿을 실온으로 가져옵니다.
   1. 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 사용하기 전에 미니 원심분리기에서 철저하고 짧게 원심분리하십시오.
2. 샘플 희석 버퍼를 희석제로 사용하여 QC 희석액을 준비합니다. 검증 정확도 및 정밀도 실행을 준비하기 위한 권장 농도의 예가 표 3에 나와 있습니다.
   알림: 정확도 및 정밀 실행이 성공적으로 완료되면 각 플레이트에서 고품질 관리(HQC), 중간 품질 관리(MQC) 및 저품질 관리(LQC)만 실행하면 됩니다. 정확도 및 정밀 실행을 위해 분석 내 정확도 및 정밀도 평가를 위해 최소 3개의 독립적인 QC 희석액이 포함됩니다. 정확도 및 정밀도 실행 후에는 하나의 희석 시리즈만 포함하면 됩니다.
3. 준비 후, 희석액을 플레이트에 첨가 될 때까지 실온에서 보관하십시오.
4. 희석액을 얼음에 보관하거나 필요한 경우 2-8°C에서 보관하십시오. 이후에 사용하기 전에 희석액을 사용하기 전에 최소 10분 동안 실온으로 데우십시오. 하루가 끝나면 QC를 폐기하십시오.

표 3: 합성 이중 가닥 DNA 단편을 사용한 품질 관리(QC) 제제의 예. 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

6. 시료 준비

1. 임상 시험에서 수집한 눈물 샘플을 실온에서 해동할 때까지 해동하고 사용하기 전에 해동 후 최소 10분 동안 따뜻하게 합니다.
   1. 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오. 사용하기 전에 마이크로 원심분리기에서 철저하고 짧게 원심분리하십시오.
2. 눈물 샘플을 1:10(또는 그 이상)으로 희석하여 0.2mL PCR 튜브 또는 8웰 PCR 스트립에 희석제로 사용합니다. 튜브를 밀봉하십시오.
   알림: 눈물 상태의 예상 목표 농도에 따라 샘플을 더 희석하거나 각 샘플의 여러 희석액을 테스트해야 할 수도 있습니다.
3. 샘플을 열 사이클러에서 95°C에서 10분 동안 가열한 다음, 4°C에서 5분 이상 유지하여 냉각시킵니다. 램프 속도 3°C/s를 사용합니다.
   참고: 샘플은 같은 날 사용할 때까지 4°C의 열 순환기에 머물거나 더 긴 보관을 위해 -70에서 -90°C에서 동결될 수 있습니다. 이 단계는 벡터 캡시드를 변성시켜 게놈을 방출하는 역할을 합니다. QC 합성 DNA 단편 또는 선형화된 플라스미드는 이중 가닥이므로 이 가열 단계를 거치지 않아야 합니다.
4. 샘플을 실온으로 냉각(또는 냉동된 경우 실온에서 해동)한 후 다시 돌려보내고 최소 10분 동안 예열합니다.
   알림: 효율적인 액적 형성을 위해 샘플을 실온으로 완전히 가져와야 합니다.

7. 템플릿 추가

1. 마스터 믹스가 포함된 ddPCR 플레이트를 검색합니다. 각 샘플 또는 QC 희석 튜브를 철저히 소용돌이 치고 간단히 원심 분리하여 재료를 회수합니다.
2. 접착 필름을 제거하고 플레이트 맵에 따라 5.5μL의 QC 또는 샘플을 96웰 플레이트의 적절한 웰에 추가합니다.
   참고: 필요한 볼륨에 대한 설명은 4.2.1단계를 참조하십시오
3. 5.5μL의 샘플 희석 버퍼를 NTC 웰에 추가합니다.
4. 액적 생성은 컬럼의 모든 웰에 반응 또는 완충액 제어가 있어야 합니다. 컬럼의 웰에 샘플 반응이 포함되어 있지 않은 경우 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 2x ddPCR 버퍼 대조군을 1:2로 희석합니다. 22μL의 1x ddPCR 버퍼 컨트롤을 컬럼의 빈 웰에 추가합니다.
   참고: 전체 컬럼을 사용하지 않는 경우 이러한 웰에 버퍼 제어를 추가할 필요가 없습니다.
5. 플레이트에 뚫을 수 있는 호일 씰을 추가합니다. 플레이트를 플레이트 실러에 넣고 180°C에서 5초 동안 밀봉합니다.
   1. 또는 ddPCR 시스템 제조업체의 권장 사항에 따라 플레이트를 밀봉합니다.
6. 플레이트를 최소 30초 동안 최대 속도로 소용돌이치고(연속 와류 설정 사용, 터치 볼텍싱을 사용하지 않음) 플레이트 스피너에서 잠시 원심분리합니다.
   참고: 이 단계에서 플레이트를 철저하고 완전하게 혼합하는 것은 PCR 반응을 액적으로 적절하게 분할하는 데 중요합니다. 우물에 기포가 보이지 않는지 확인하십시오. 필요한 경우 액적 생성 전에 플레이트를 2-8°C에서 최대 4시간 동안 유지할 수 있습니다. 잡고 있는 경우 물방울이 생성되기 전에 플레이트를 최소 10분 동안 실온에 두십시오.

8. 자동 액적 생성, 열 순환 및 액적 판독

1. 다음과 같이 자동 액적 발생기에서 액적을 생성합니다.
   1. 터치 스크린에서 샘플이 포함된 플레이트 맵의 열을 선택합니다. 기기의 데크에 불이 들어와 필요한 소모품(DG32 카트리지, 팁, 폐기물 용기, 액적 생성 오일)을 나타냅니다. 노란색 표시등은 소모품을 추가해야 함을 나타내고 녹색 표시등은 사용 가능한 소모품이 충분함을 나타냅니다.
   2. 액적 발생기를 뒤에서 앞으로 로드합니다.
   3. 가수분해 프로브의 경우 프로브용 액적 생성 오일이 설치되어 있고 유정 수에 맞는 충분한 오일이 남아 있는지 확인하십시오. 대체 PCR 케미스트리를 사용하는 경우 호환 가능한 액적 생성 오일이 설치되어 있는지 확인하십시오.
   4. 액적 플레이트 홀더에 콜드 블록을 놓습니다. 블록이 완전히 파란색이고 분홍색이 보이지 않는지 확인합니다. 콜드 블록에 새 96웰 ddPCR 플레이트를 놓습니다.
   5. 준비된 PCR 플레이트를 샘플 플레이트 홀더에 넣습니다. 기계 뚜껑을 닫습니다. 물방울 생성을 위해 시작을 누릅니다.
2. 액적 형성 후 반응당 총 40μL가 자동으로 새 PCR 플레이트로 전달됩니다.
3. 액적 생성 완료 후 30분 이내에 콜드 블록에서 액적이 포함된 플레이트를 제거합니다. 이 단계에서 물방울이 가장 약하므로 부드럽게 작업하십시오.
4. 플레이트에 뚫을 수 있는 호일 씰을 추가합니다. 플레이트를 플레이트 실러에 넣고 180°C에서 5초 동안 밀봉합니다.
   1. 또는 ddPCR 시스템 제조업체의 권장 사항에 따라 플레이트를 밀봉합니다.
5. 호환되는 열 순환기에 플레이트를 놓습니다. 사이클링 조건을 입력합니다( 표 4 참조).
6. 열 사이클링이 끝나면 플레이트를 열 사이클러에 고정하거나 2-8 °C로 옮기거나 즉시 읽으십시오.
   알림: 플레이트를 12-4°C에서 12시간 동안 유지하면 액적 수가 향상될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아닙니다. 홀드 없이 충분한 물방울을 얻어야 합니다.
7. 플레이트를 액적 판독기에 로드하여 충분한 판독기 오일이 남아 있고 폐기물 용기에 충분한 공간이 있는지 확인합니다. 물방울을 읽으십시오. 열 순환 시작 후 24시간 이내에 액적 판독을 수행합니다.

표 4: 일반적인 열 순환 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

9. 데이터 분석

알림: 포아송 통계를 사용하여 적절한 농도 계산을 위해서는 웰당 최소 10,000개의 물방울이 필요합니다. 물방울이 10,000개 미만인 웰에 대한 분석을 시도하지 마십시오.

1. 물방울을 양수 또는 음수로 정의하려면 임계값이 필요합니다. ddPCR 분석 소프트웨어는 웰에 따라 다를 수 있는 임계값을 자동으로 적용합니다. 그러나 보다 일관되고 정확하며 정밀한 결과를 위해 NTC 웰의 형광 강도보다 약간 높은 플레이트의 모든 웰에 대한 임계값을 수동으로 설정합니다.
   알림: 임계값의 적절한 배치는 양적 물방울과 음수 물방울의 분리와 얼마나 많은 물방울 비가 존재하는지에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다( 그림 2 참조). 이 예에서 액적 진폭 그래프는 각 QC 레벨과 NTC의 웰 예를 보여줍니다. 보라색 선은 임계값 1,000을 나타내며 음의 물방울 개체군보다 약간 높게 설정됩니다.
2. 푸아송 통계 모델링은 95% 신뢰도로 농도를 계산하기 위해 최소 3개의 양의 물방울이 필요합니다. 0, 1 또는 2 개의 양의 물방울을 포함하는 모든 웰을 음수로 간주하고 0²⁷의 농도로 설정하십시오.
3. 각 눈물 샘플의 복제 수를 역계산합니다.
   1. 농도(copies/μL)는 데이터 보고서에 제공됩니다. 이 값을 사용하여 원본 샘플(즉, 눈물 샘플)의 copies/μL 농도를 결정합니다.
   2. ddPCR 반응 희석액을 계산하기 위해, 액적 형성 전의 초기 PCR 반응 부피를 주형의 첨가 부피로 나눕니다. 이 방법에 제시된 볼륨을 활용하면 값 4가 생성됩니다.
      
   3. 원래 샘플에서 연속 희석 계수를 결정합니다(6.2단계).
   4. 샘플의 사본/μL을 결정하려면 사본/μL에 ddPCR 반응 희석을 곱한 다음 직렬 희석 계수를 곱합니다. 예를 들어, 데이터 보고서에서 생성된 copies/μL 단위의 농도는 966이었습니다. 반응 22 μL당 5.5 μL의 주형을 첨가하였다. 샘플의 1:50,000 연속 희석이 활용되었습니다.
      
      
   5. 동일한 샘플의 여러 희석액을 테스트한 경우 모든 유효한 범위 내 희석액을 분석하고 평균을 계산합니다.
4. 각 QC에 대해 주어진 QC 희석의 농도(사본/μL)를 ddPCR 반응 부피(20μL)로 나누어 예상 copies/μL PCR 반응을 계산합니다. 이를 통해 추가 계산 없이 이 공칭 값을 데이터 보고서에 제공된 copies/μL 값과 직접 비교할 수 있습니다.
   참고: 이 접근법은 대표 결과에 사용된 스파이크 눈물 샘플의 분석에도 사용되었습니다.
5. 복제 웰을 사용하여 샘플의 공칭 농도(%RE)에 대한 평균값, 표준 편차, 변동 계수(%CV) 및 상대 오차 백분율 또는 QC 값을 결정합니다(해당되는 경우 여러 희석 포함).
   1. 웰 간 정밀도를 평가하려면 각 웰 중복(포함된 경우)에 대해 이를 결정합니다.
   2. 분석 내 정확도 및 정밀도를 평가하려면 배치 내에서 사용되는 각 희석 시리즈 또는 분취량에 대해 이를 결정합니다.
   3. 분석 간 정확도 및 정밀도를 평가하기 위해 포함된 각 배치의 내부 분석 수단을 사용하여 이를 결정합니다.

그림 2: 임계값 설정의 예. 약어: ULQC = 상한 품질 관리; HQC = 높은 품질 관리; MQC = 중간 품질 관리; LQC = 낮은 품질 관리; LLQC = 하한 품질 관리; NTC = 템플릿 컨트롤 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

10. 분석 허용 기준

1. 각 배치에 대해 계산된 데이터에 다음 사양을 활용하여 배치가 허용 가능한지 여부를 확인합니다. 이러한 조건이 충족되지 않으면 배치를 무효화하고 반복합니다.
   참고: 이러한 기준은 PCR 기반 분석 검증 18,19,20,21,22,23,24,25에 대해 발표된 백서의 합의로 결정되었습니다. 임상 적용에 적합하도록 대상 기준을 수정해야 할 수도 있습니다.
2. 템플릿 컨트롤 없음(NTC)
   1. 각 NTC 웰에 최소 10,000개의 물방울이 있는지 확인합니다.
   2. 각 NTC 웰에 3개 미만의 양의 물방울이 있는지 확인합니다.
3. QC 및 분석 범위
   1. 각 QC 웰에 최소 10,000개의 물방울이 있는지 확인합니다.
   2. ≤30.0%가 허용되는 정량의 상한 및 하한을 제외하고 QC 농도의 복제 웰의 정밀도가 ≤25.0% CV인지 확인하십시오. 각 QC 세트 및 농도 수준에 대해 독립적으로 평가합니다.
   3. ±30.0% RE가 허용되는 정량의 상한 및 하한을 제외하고 각 평균 QC 수준에서 역계산된 농도의 상대 오차가 공칭 농도(사본/PCR 반응)의 ±25.0% RE 이내인지 확인합니다. 각 QC 세트 및 농도 수준에 대해 독립적으로 평가합니다.
   4. QC 샘플의 2/3 이상(예: 6개 결과 중 4개)과 각 수준(낮음, 중간, 높음)의 QC 샘플의 50%가 이 지침을 충족하는지 확인합니다.
4. 샘플
   1. 분석할 샘플 웰에 최소 10,000개의 물방울이 있는지 확인합니다.
   2. 분석할 샘플 희석액의 복제 웰의 정밀도가 ≤25.0% CV인지 확인하십시오.
   3. 주어진 샘플의 적어도 하나의 포함된 희석이 상한 및 하한 QC를 기반으로 위에서 정의한 대로 분석의 정의된 정량 범위 내에 있는지 확인하십시오.
   4. 모든 희석액에 정의된 정량 상한보다 큰 수율 결과가 포함되어 있고 충분한 샘플 부피가 남아 있는 경우 더 높은 희석액을 사용하여 분석을 반복합니다.amp르.
   5. 포함된 모든 희석액이 정량 하한보다 낮은 결과를 산출하고 충분한 샘플 부피가 남아 있는 경우 샘플의 더 낮은 희석액을 사용하여 분석을 반복합니다.
      참고: 3개 이상의 양성 방울을 포함하지만 정량 하한보다 낮은 농도를 갖는 샘플은 검출 가능한 것으로 설명할 수 있지만 정량화할 수는 없습니다.

토론

분석의 적절한 수행에 중요한 ddPCR 프로토콜의 여러 단계가 있습니다. 첫 번째 중요한 단계는 프라이머와 프로브의 설계 및 최적화입니다. 일반적으로 전임상 또는 임상 환경에서 염료 기반 화학(예: SYBR Green)보다 가수분해 프로브 기반 화학을 사용하는 것이 우수하기 때문에 권장됩니다. 또한 증폭 대상의 선택은 매우 중요합니다. 전형적으로, 벡터의 관심있는 도입 유전자가 표적화된다. 그러나, 초기 전임상 단계 또는 벡터 이식유전자 대 게놈 DNA를 구별하는 것이 불가능할 수 있는 벡터에서는 표준화된 벡터 표적을 사용하는 것이 적절할 수 있습니다. 예를 들어, 반전된 말단 반복 영역, 프로모터, poly-A 꼬리 또는 이러한 벡터 구성 요소 사이의 세그먼트 간 접합부를 대상으로 할 수 있습니다. 타겟 선택은 벡터 설계에 따라 달라집니다. 기존의 qPCR 프라이머 및 프로브 설계 전략과 소프트웨어는 일반적으로 ddPCR에 적합합니다. 일관된 어닐링 온도(예: 60°C)를 생성할 것으로 예상되는 설계 매개변수를 선택하여 필요한 최적화의 양을 줄여야 합니다. 또한 각 대상에 대해 최소 3개의 서로 다른 세트를 설계, 주문 및 평가하는 것이 좋습니다. 그런 다음 가장 큰 특이성(음성 대조군 웰 또는 관련 표적 DNA 매트릭스에서 증폭 없음)과 민감도(즉, 검출 한계)를 나타내는 세트를 선택해야 합니다²⁰.

qPCR과 ddPCR 사이에서 분석을 전환할 수 있는 것이 유리한 경우 먼저 qPCR을 사용하여 분석 조건을 최적화하고^R2 ≥ 0.98로 증폭 효율이 90%-110%인 선택된 세트에 대한 조건을 식별하는 것이 좋습니다. 그러나 종말점 방법으로서의 ddPCR은 증폭 효율의 차이로 인해 일반적으로 qPCR보다 덜 민감합니다. 최소한 어닐링/확장 단계에서 열 온도 구배를 실행하여 예상 어닐링 온도보다 높거나 낮은 온도를 커버하고 온도의 함수로 음과 양의 액적 클러스터 사이의 비 및 형광 진폭 분리를 평가하는 것이 좋습니다. 작업 공간이 허용하는 경우 마스터 믹스 준비, 템플릿 추가 및 증폭을 위한 개별 전용 워크스테이션을 사용하는 것이 좋습니다. 가능한 경우, 교차 오염 및 오탐의 위험을 줄이기 위해 제어된 접근 및 차동 공기압과 같은 내장된 엔지니어링 제어 기능이 있는 단방향 워크플로에 의해 물리적으로 분리되어야 합니다. 이것이 가능하지 않은 경우 교차 오염을 방지하기 위해 각별한 주의를 기울여야 합니다.

이 프로토콜에는 qPCR 분석 개발에 더 익숙한 사람들에게 이상하게 보일 수 있는 두 단계가 있습니다. 첫 번째는 PCR 마스터 믹스에 제한 효소를 포함시키는 것입니다. ddPCR 증폭 동안 각 액적은 종말점까지 열순환됩니다. 적절하게 최적화된 분석에서 두 개의 입자 집단이 생성되는데, 한 세트는 일관되게 높은 수준의 형광 신호(양성)를 표시하고 다른 세트는 낮은 수준의 형광 신호(음성)를 일관되게 표시합니다. PCR 간섭이 발생하면 PCR 증폭의 시작을 비동기화하여 액적이 증폭 고원에 도달하지 못하여 형광 종말점이 일관되지 않을 수 있습니다. 이 경우 물방울이 음성과 양성 사이에 분포되어 ddPCR 비라는 현상이 발생합니다. 이로 인해 목표의 부정확한 정량화가 발생하고 임계값이 일관되지 않고 주관적으로 적용될 수 있습니다. 임계값을 NTC의 신호보다 약간 높게 설정하는 것이 좋으며, 이는 모든 물방울이 종점으로 완전히 순환되지 않더라도 여전히 양수로 간주되므로 최종 정량화에서 비의 영향을 최소화해야 합니다. AAV는 증폭 대상에 따라 프라이머와 프로브에 대한 접근성을 감소시켜 PCR 간섭을 일으켜 비가 내릴 수 있는 매우 복잡한 2차 구조를 가지고 있습니다. 마스터 믹스에 제한 효소를 포함시키면 이 2차 구조가 절단되어 프라이머와 프로브의 접근이 증가하여 비가 줄어들어 분석의 정확도가 향상될 수 있습니다. ddPCR 반응에 제한 효소를 포함시키는 효과는 이전에^25,32에 기재되어 있다. 임의의 제한 효소는 표적 증폭 영역 내에서 절단되지 않는 것으로 확인되는 한 사용될 수 있다. 소화 전 단계나 대체 완충액 조성이 필요하지 않습니다.

두 번째 특이한 단계는 AAV를 함유한 눈물 샘플을 준비하는 것입니다. 이 프로토콜에서는 1:10(또는 그 이상)의 눈물 비율을 활용한 후 샘플을 가열했습니다. 전형적으로, 눈물이 모세관을 통해 수집될 때, 이는 널리 이용되는 수집 방법이며, 평균적으로 약 10.0 μL가 수집될 수 있다³³. 희석은 제한된 샘플 부피를 해결하고 중복 웰 테스트를 위한 충분한 재료를 제공하는 데 도움이 됩니다. 이렇게 하면 이론적인 검출 한계가 줄어들지만 ddPCR의 강력한 감도는 여전히 극소수의 벡터 입자를 제외한 모든 입자를 검출해야 합니다. 이 접근 방식은 예기치 않게 실패할 경우 "백업" 우물을 추가로 만듭니다. 이 경우 또는 두 개의 웰을 실행하기에 불충분한 샘플 부피의 경우 푸아송 오차를 사용하여 정밀도를 평가할 수 있습니다. 또한 농도가 검출 한계 미만인 경우 웰 데이터를 병합하여 농도를 결정할 수 있는 기회를 제공합니다. ddPCR 검출을 위해 바이러스 캡시드로부터 AAV 벡터를 유리시킬 필요가 있다. AAV의 정량화를 위한 몇몇 방법들은 바이러스 캡시드^34,35,36을 제거하기 위한 프로테이나제 K 소화 단계를 포함하였다. 자연적으로 발생하는 모든 AAV 혈청형은 녹는 온도가 약 90°C 이하이며 대부분이 80°C 이하로 떨어집니다. 따라서 이것은 불필요한 포함으로 보입니다³⁷. 가열만으로도 벡터 DNA를 방출하기에 충분한 것으로 보입니다.

또한, ddPCR은 일반적으로 qPCR 분석에 영향을 미칠 수 있는 샘플에 존재할 수 있는 PCR 억제제에 덜 민감합니다. 특정 DNA 분리 단계가 포함된 경우 특정 검증도 필요하며 이 프로토콜에서는 이를 피합니다. 샘플은 액체에서 벡터 게놈의 확산 동역학으로 인해 가열되기 전에 희석됩니다. 가열 및 후속 냉각 과정 동안, 단일 가닥 DNA 게놈의 양성 및 음성 센스 가닥은 농도가 충분히 높은 경우 함께 어닐링되어 이중 가닥 중간체를 생성할 수 있습니다. 가열 전 희석은 농도를 감소시키고 정량화의 정확도에 악영향을 미칠 만큼 충분한 이중 가닥 중간체가 형성될 가능성을 수학적으로 낮춥니다. 품질 관리로 사용되는 합성 DNA 단편 또는 선형화된 플라스미드는 이러한 가열 단계를 거치지 않아야 한다는 점에 유의해야 합니다. 이들은 이중 가닥이기 때문에 가열하면 단일 가닥 중간체로 전환됩니다. 이러한 단일 가닥 QC를 액적으로 독립적으로 분할한 후 공칭 농도에 비해 QC 농도가 2배 증가할 것으로 예상됩니다. 또는 방법을 표준화하기 위해 QC를 가열해야 하는 경우 이를 공칭 농도의 재구성 및 할당에 고려해야 합니다.

마지막으로, 샘플 준비와 관련하여 많은 프로토콜에서는 캡슐화되지 않은 벡터 DNA를 제거하기 위해 DNase 처리 단계를 포함할 것을 권장합니다. 이 단계는 벡터 제제와 관련된 유리 DNA를 정량화하는 것이 바람직하지 않은 경우(예: 투여 목적을 위한 정량화 중)에 중요합니다. 그러나 생체 분포 및 생물 흘리기 연구의 맥락에서 일반적으로 벡터 DNA가 캡슐화되었는지 여부에 관계없이 어디로 이동했는지 알고 싶어합니다. 따라서 일반적으로 이러한 연구 중에 DNase 처리 단계를 수행하지 않는 것이 좋습니다. DNase 단계를 포함할 필요가 있다고 판단되는 경우, 이 단계는 희석 및 가열 전에 이루어져야 한다.

이 논문에서는 목적에 맞는 우수한 실험실 관행 준수 검증의 맥락에서 방법의 동적 범위, 감도, 정확도 및 정밀도를 평가하는 접근 방식을 나타내는 데이터를 제시합니다. 현재 이 주제에 대한 지침이 없기 때문에 검증 실험실은 현재 업계의 생각에 따라 자체적으로 표적 분석 기준을 결정해야 합니다. 다른 그룹은 이 연구에서 사용된 것보다 더 높은 목표 기준과 더 낮은 목표 기준을 모두 제시했습니다(19,20,21,22,23,24,25). 표적 분석 기준은 보다 엄격하게 정의될 때까지 방법의 의도된 임상 적용에 따라 검증 전에 선택해야 합니다. 데이터를 기반으로 내려지는 다운스트림 결정에 따라 더 높은 수준의 정확도와 정밀도가 필요할 수 있습니다. 반대로, 단순한 긍정 대 부정 결과만으로도 충분할 수 있습니다.

이 접근법은 또한 특이성 및 매트릭스 효과 평가에 대한 권장 사항을 다루었습니다. 치료받지 않은 개인으로부터 수집된 눈물 풀은 이 분석에서 긍정적인 결과를 생성하지 못한 반면, 벡터가 권장 회수율 내에서 높고 낮은 농도로 눈물에 스파이크되었을 때 표적을 검출할 수 있었습니다. 이상적으로는, 내인성 벡터를 함유하는 매트릭스(예를 들어, 바이러스 벡터로 처리한 후 수집됨)도 이러한 평가에 포함될 것이다. 그러나 이러한 샘플을 유효성 검사에 사용할 수 있을 가능성은 거의 없습니다. 검증의 견고성을 높이기 위해 여러 눈물 풀 또는 다양한 개인으로부터 수집한 눈물을 평가하여 환자별 매트릭스 효과가 발생하는지 확인할 수 있습니다. 마지막으로 안정성을 평가하는 것이 좋습니다. 생물학적 매트릭스에서 DNA 추출이 이루어지는 워크플로우에서는 샘플과 추출된 DNA의 안정성을 평가해야 할 수 있습니다. 이 워크플로우에서 샘플은 DNA 추출 없이 분석에서 직접 테스트됩니다. 따라서, 이 방법에 대한 안정성의 평가를 고려하여, 인열 샘플의 안정성을 평가해야 한다. 일반적으로 탁상용, 냉장고, 냉동/해동 및 장기 안정성 평가가 권장됩니다. 이는 이 연구의 일부로 수행되지 않았지만 여기에서 개발된 방법은 입력 샘플을 조작한 후 이 평가에 사용할 수 있습니다.

전반적으로, 이 방법은 눈물 샘플에서 AAV 기반 벡터를 검출하기 위한 강력하고 반복 가능하며 검증 가능한 분석임이 입증되었습니다. 임상 시험을 지원하기 위해 특정 벡터에 적용할 수 있는 플랫폼 역할을 할 수 있으며 우수한 실험실 관행과 일치하는 분석의 검증을 위한 기초를 제공합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV-eGFP Vector	Charles River Laboratories	RS-AAV2-FL	Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector
AutoDG Droplet Digital PCR system	Bio-Rad	QX200	Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
AutoDG Oil for Probes	Bio-Rad	1864110	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Buffer Control for Probes	Bio-Rad	1863052	Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad	1863004	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Piercable Foil Seals	Bio-Rad	1814040	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad	12001925	Or use material compatible with ddPCR system.
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)	Bio-Rad	1863023, 1863024, or 1863025	Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.
DG32 AutoDG Cartidges	Bio-Rad	1864108	Or use material compatible with ddPCR system.
Droplet Reader	Bio-Rad	QX200	Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol.
GeneAmp PCR Buffer	Applied Biosystems	N8080129	N/A
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9906	N/A
PCR Plate Sealer	Bio-Rad	PX1	Or use material compatible with ddPCR system.
Pipet Tips for AutoDG	Bio-Rad	1864120	Or use material compatible with ddPCR system.
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant	Gibco	24040	N/A
Primer and Hydrolysis Probes	Various	Various	Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.
Restriction Enzyme	Various	Various	Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence
Sheared salmon sperm DNA	ThermoFisher	AM9680	N/A
Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid	Various	Various	Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control
TE Buffer	Teknova	T0224	Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0
Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	C1000	Or use material compatible with ddPCR system.