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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un modello murino di carcinoma colorettale associato a coloproctite ulcerosa indotto da azometano combinato con destrano solfato di sodio. Il modello è stato utilizzato per valutare l'efficacia dei composti della medicina tradizionale cinese nella prevenzione e nel trattamento del cancro del colon-retto.

Abstract

Il cancro del colon-retto (CRC) è un tumore maligno comune dell'apparato digerente ed è diventato il terzo tumore maligno più comune in tutto il mondo e la seconda causa di morte correlata al tumore maligno. La coloproctite ulcerosa (CU) è una lesione precancerosa e la CRC associata alla CC (UC-CRC) è il sottotipo più comune di CRC. Pertanto, un modello UC-CRC ragionevole è la pietra angolare e la garanzia dello sviluppo di nuovi farmaci. La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata ampiamente utilizzata nel trattamento della UC-CRC grazie alla sua buona efficacia. Come classica prescrizione tonica della MTC, il decotto di Liujunzi (LJZD) è stato ampiamente utilizzato nel trattamento della UC-CRC. In questo studio, è stato stabilito un modello UC-CRC combinando azometano e destrano solfato di sodio ed è stato somministrato il LJZD. I dati hanno confermato che LJZD può inibire efficacemente la transizione del cancro in UC-CRC utilizzando il peso corporeo del topo, la lunghezza del colon-retto, i fattori patologici e infiammatori, la funzione della barriera colorettale e i marcatori tumorali. Questo protocollo fornisce un sistema per valutare l'efficacia della MTC nella prevenzione e nel trattamento della UC-CRC.

Introduzione

Il cancro del colon-retto (CRC) è un tumore maligno gastrointestinale comune, il terzo tumore maligno più comune e la seconda causa di morte più comune al mondo, rappresentando il 10% dell'incidenza globale del cancro e il 9,4% del totale dei decessi correlati al cancro 1,2. Fattori genetici, infiammazione cronica, dieta ricca di grassi, diabete e flora intestinale anormale sono fattori di rischio per il CRC 3,4. Tra questi, la malattia infiammatoria intestinale, in particolare la coloproctite ulcerosa (CU), è un chiaro fattore di rischio per il CRC 5,6. La RCC associata alla UC (UC-CRC) è un processo di transizione dell'infiammazione, dell'iperplasia atipica e del cancro basato sull'infiammazione cronica del colon-retto, che è diverso dal tipico modello di sviluppo adenoma-adenocarcinoma del CRC 7,8. Rispetto alla popolazione generale, il rischio di CRC è circa 10-40 volte superiore nei pazienti con malattia infiammatoriaintestinale 9.

Attualmente, la chirurgia è ancora il trattamento standard per il CRC e, a seconda della posizione e dello stadio del tumore, è possibile la radioterapia, la terapia farmacologica sistemica o una combinazione di entrambe10. Sebbene queste modalità di trattamento tradizionali abbiano fatto grandi progressi, a causa dell'elevata eterogeneità e del tasso di recidiva del CRC, la prognosi è sfavorevole e l'effetto del trattamento non è ideale11,12. Pertanto, la diagnosi precoce, la diagnosi precoce e il trattamento completo sono fondamentali per migliorare il tasso di sopravvivenza dei pazienti con CRC ed è particolarmente importante prestare attenzione alla trasformazione della CU in CRC. Nel corso degli anni, la medicina tradizionale cinese (MTC) ha attirato molta attenzione nel trattamento della UC-CRC o gastrite cronica a causa dei suoi limitati effetti collaterali e della sua significativa efficacia. Sulla base del trattamento dialettico, famosi praticanti di medicina cinese di varie generazioni hanno creato un gran numero di prescrizioni classiche, come il decotto Huangqi Jianzhong13, il decotto Sijunzi14 e la pillola Sishen15.

Il decotto di Liujunzi (LJZD) ha avuto origine dalle opere di Yi Xue Zheng Zhuan compilate durante la dinastia Ming ed è una prescrizione classica della MTC16. Come mostrato nella Tabella 1, LJZD è costituito da sei erbe tradizionali, tra cui Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Cocco di Poria (Schw.) Lupo (Fuling), Macrocephala Koidz di Atractylodes. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Ganção), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) e Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), che ha l'effetto di reintegrare il qi e rafforzare la milza, asciugare l'umidità e risolvere il catarro. Nella pratica clinica moderna, viene spesso utilizzato per trattare la gastrite cronica, le ulcere gastriche e le ulcere duodenali. La moderna ricerca farmacologica ha dimostrato che la LJZD e la LJZD modificata hanno un alto valore applicativo nel trattamento adiuvante della CU e del cancro del tratto digestivo 17,18,19.

Attualmente, ci sono molti modi per costruire modelli murini UC-CRC, ma il modello murino indotto da azossimetano (AOM)/destrano solfato di sodio (DSS) è il modello UC-CRC più utilizzato; i sintomi clinici, le osservazioni morfologiche e patologiche hanno dimostrato che il modello è molto simile all'UC-CRCumano 20,21. Il principio di base è quello di indurre prima la cancerogenesi con l'agente cancerogeno chimico AOM e poi esporre continuamente i topi all'ambiente di stimolazione infiammatoria del DSS per simulare il danno continuo e la riparazione dell'epitelio della mucosa intestinale, costruendo così un modello murino UC-CRC22. Lo scopo di questo studio è quello di stabilire un modello murino di UC-CRC mediante iniezione intraperitoneale di AOM e stimolazione ciclica di DSS a breve termine e di valutare l'effetto del farmaco e il meccanismo molecolare di LJZD su UC-CRC al fine di fornire una base scientifica per il trattamento di UC-CRC.

Protocollo

La procedura sugli animali è stata approvata dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (Numero di registrazione: 2021214). Topi C57BL/6J privi di patogeni specifici (8-10 settimane, peso 18-22 g), maschi e femmine, sono stati alloggiati in gabbie ventilate in modo indipendente a 22 °C e 65% di umidità relativa. I topi hanno iniziato l'esperimento dopo 7 giorni di alimentazione adattativa, durante i quali hanno avuto libero accesso all'acqua e alla dieta.

1. Preparazione del farmaco

  1. Preparazione di LJZD
    NOTA: La medicina cinese utilizzata è stata acquistata presso l'Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Changchun ed è stata identificata come vera medicina cinese (vedi Tabella 1).
    1. Metti Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) in un vaso di ceramica specializzato (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 1000 mL di acqua distillata e lasciare in ammollo a temperatura ambiente per 1 ora (vedi Figura 1A).
    2. Polvere 12 g Versare in polvere fine con un macinino e immergere in 300 ml di acqua distillata in un altro contenitore per 1 ora a temperatura ambiente.
    3. Mescola la medicina cinese di cui sopra nel vaso di ceramica specializzato. Far bollire il composto e poi tenere a fiamma media fino a quando non rimangono solo 300 ml di decotto. Utilizzare una garza medica per filtrare e conservare il filtrato a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere 1000 ml di acqua distillata e ripetere nuovamente l'operazione di decotto di cui sopra. Filtrare nuovamente con una garza medica. Unire il filtrato e farlo bollire fino a quando rimangono solo 150 ml.
    5. Centrifugare il liquido concentrato a 10.000 x g per 5 minuti e concentrare ulteriormente il surnatante ottenuto a 30 mL a fuoco medio. Trasferisci il concentrato finale in un piatto e asciugalo utilizzando un forno elettrico di essiccazione fino a quando rimane solo il soluto sotto forma di polvere.
    6. Pesare il solido di cui sopra e scioglierlo in acqua distillata sterile per ottenere una soluzione contenente 22,85 mg di farmaco per 0,2 mL (114,16 mg/mL), che è la dose giornaliera dei topi.
  2. Preparazione dell'acido 5-amminosalicilico
    NOTA: L'acido salicilico 5-amminoacido (5-ASA; vedere la tabella dei materiali) ha un buon effetto preventivo sull'UC-CRC ed è stato utilizzato come farmaco positivo in questo studio23.
    1. Sciogliere 64 mg di polvere di 5-ASA in 200 mL di acqua distillata sterile per ottenere una soluzione di 5-ASA 1,82 mg/mL. La dose giornaliera per un singolo topo è stata di 0,2 ml.
  3. Preparazione della soluzione iniettabile di AOM
    1. Aggiungere 2,5 mL di acqua distillata sterile in polvere AOM da 25 mg (vedere la tabella dei materiali) e mescolare con un miscelatore a vortice (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una soluzione madre AOM da 10 mg/mL, conservare a -20 °C fino all'uso.
    2. Preparare la soluzione iniettabile di AOM diluendo la soluzione madre AOM con acqua distillata sterile a 10:1 (1 mg/mL).

2. Istituzione del modello UC-CRC

NOTA: L'esperimento è stato diviso in 4 gruppi: controllo, modello, LJZD e gruppo 5-ASA, 10 topi in ciascun gruppo. Ad eccezione del gruppo di controllo, gli altri gruppi sono stati trattati con AOM e DSS.

  1. Iniezione intraperitoneale di soluzione iniettabile AOM
    NOTA: Dopo l'alimentazione adattativa per 7 giorni, ai topi è stata somministrata una soluzione iniettabile di AOM (1 mg/mL) mediante iniezione intraperitoneale (vedere Figura 1B).
    1. Tieni il mouse con la pancia in alto e la testa leggermente in basso. Afferrare la pelle posteriore per stringere la pelle addominale e perforare la pelle a circa 1 cm a destra dell'intersezione della linea radicolare di entrambe le cosce sulla linea dell'addome medio con una siringa da 1 mL (vedere Tabella dei materiali).
    2. Spingere l'ago della siringa da 1 mL a una distanza di 3-5 mm sotto la pelle, mantenendolo parallelo alla linea mediana addominale, e inserire l'ago di 0,3-0,5 mm nella cavità addominale a 45°.
    3. Dopo che la punta ha attraversato il muscolo addominale, l'operatore avverte un'improvvisa perdita di resistenza. Successivamente, tirare la siringa verso l'esterno e all'indietro per osservare se si verificano infiltrazioni di liquido. In caso contrario, spingere lentamente la soluzione iniettabile di AOM nei topi a 0,1 mL/10 g.
  2. Stimolazione ciclica della soluzione di DSS al 2%
    NOTA: A ciascun topo indotto da AOM sono stati somministrati 500 mL di soluzione DSS alle settimane 3, 6 e 9 e i topi hanno bevuto liberamente durante questo periodo.
    1. Preparare una soluzione di DSS al 2% aggiungendo 500 mL di acqua distillata sterile a 10 g di DSS (vedere la tabella dei materiali). Miscelare con miscelatore a vortice e conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
    2. Ogni topo indotto da AOM beve liberamente 500 mL di soluzione di DSS al 2% per 7 giorni nelle settimane 3, 6 e 9 dopo l'induzione dell'AOM.

3. Trattamento farmacologico

NOTA: Gli esseri umani adulti hanno bisogno di 63 g di LJZD al giorno. Secondo la formula di conversione della dose sperimentale di farmaci per topi e per l'uomo, dose sperimentale equivalente per topi (mg/kg) = dose umana (mg/kg)/peso corporeo (60 kg) x 9,1, la dose giornaliera di topi era di circa 9,6 g/kg.

  1. Trattare il gruppo LJZD e 5-ASA con 0,1 mL/10 g della soluzione preparata di LJZD e 5-ASA mediante sonda gastrica rispettivamente alla settimana 7 e alla settimana 15.
    1. Per la somministrazione intragastrica nei topi, eseguire la seguente procedura. Tenere il mouse con la mano sinistra e con la mano destra tenere l'apparecchio per la perfusione dello stomaco. Inserire l'ago della siringa in bocca e farlo scorrere lungo la parete posteriore della faringe dei topi. Scivola lungo la faringe mentre i topi deglutiscono e continua ad andare avanti. Quando c'era un senso di resistenza e la siringa poteva essere spinta nella faringe, estrarre l'ago e completare l'iniezione.
  2. Trattare il gruppo di controllo e il gruppo modello con la stessa quantità di soluzione fisiologica (vedi Tabella dei materiali).
  3. Trattare i topi di ciascun gruppo con un farmaco appropriato una volta al giorno alla stessa ora durante il periodo di somministrazione.

4. Valutazione del modello UC-CRC e dell'efficacia di LJZD

  1. Punteggio dell'indice di attività della malattia
    NOTA: Secondo la Tabella 2, il punteggio dell'indice di attività della malattia (DAI) è stato valutato combinando la perdita di peso, la viscosità fecale e il sanguinamento delle feci dei topi.
    1. Registrare il peso dei topi ogni giorno dall'inizio dell'alimentazione adattativa fino alla fine del trattamento farmacologico.
    2. Osserva attentamente la consistenza fecale di ogni topo sperimentale e registra i movimenti intestinali come una delle tre condizioni: feci normali e molli e diarrea acquosa.
    3. Registrare il sanguinamento fecale degli animali da esperimento come una delle tre condizioni: nessun sanguinamento, poco sanguinamento e sangue visibile nelle feci.
  2. Rilevamento del livello di IL-6 nel siero
    1. Trattare i topi con LJZD o 5-ASA per 9 settimane. Fissare i topi afferrando la pelle del collo del topo con la mano sinistra e premendo delicatamente sul tavolo sperimentale per assumere la posizione di decubito laterale. Taglia i baffi dei topi con le forbici. Tagliare con cura i baffi dei topi con le forbici (vedere la tabella dei materiali) per evitare la contaminazione del sangue.
      NOTA: I topi che non potevano muoversi liberamente sono stati considerati correttamente riparati. Se ciò non accade, i topi dovrebbero essere riparati.
    2. Anestetizzare il topo mediante inalazione di isoflurano al 2%. Sterilizzare la pelle intorno al bulbo oculare con etanolo (vedere la tabella dei materiali). Premere delicatamente la pelle dell'occhio sul lato per rendere il bulbo oculare congestionato e sporgente.
    3. Bloccare il bulbo oculare con una pinzetta a gomito e rimuovere i bulbi oculari in modo accurato e rapido. Lasciare gocciolare il sangue nella provetta centrifuga (vedi Tabella dei materiali). Nel processo, tocca il cuore del mouse per accelerare la raccolta del sangue.
    4. Tenere il sangue raccolto a temperatura ambiente per 30 minuti e centrifugarlo a 3.500 x g per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e rilevare il livello di IL-6 secondo le istruzioni del kit di rilevamento del contenuto di IL-6 (vedere la tabella dei materiali).
  3. Separazione del tessuto colorettale
    1. Sopprimere i topi dopo il prelievo di sangue inalando il 5% di isoflurano sovradosato e lussazione cervicale (vedi Tabella dei materiali) in conformità con l'etica animale.
    2. Tenere i topi in un ambiente anatomico criogenico. Immobilizzare i topi in posizione supina. Tagliare i peli del basso ventre con le forbici e sterilizzarli con etanolo.
    3. Pizzicare il punto di intersezione tra le due radici della coscia e la linea mediana addominale con una pinza palpebrale (vedi Tabella dei materiali). Praticare un'incisione trasversale di circa 1-1,5 cm con le forbici.
    4. Praticare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana dell'addome dal punto medio dell'incisione trasversale verso il processo xifoideo.
    5. Rimuovere i tessuti peri-colorettali in direzione dell'ano per separare il colon-retto dal tessuto circostante. Fare attenzione a non danneggiare il colon-retto.
    6. Spingi la pelle dell'addome ai lati per esporre completamente il colon-retto. Rimuovere il colorectum dalla cavità addominale con una pinza palpebrale e tagliare i segmenti dall'ano al cieco (escluso); La lunghezza totale è di circa 10 cm. Conservare i tessuti colorettali ottenuti in soluzione fisiologica a 4 °C.
  4. Valutazione della lunghezza e del peso del retto
    1. Estrarre la soluzione fisiologica a 4 °C con un ago da 5 mL (vedi Tabella dei materiali) per lavare l'interno del colon-retto. Quindi, posizionare il colorectum su carta assorbente per assorbire l'umidità del tessuto.
    2. Pesare i tessuti colorettali e poi posizionarli su un foglio A4 per misurarne la lunghezza.
  5. Misurare il numero di tumori nel colon-retto
    1. Taglia il colorectum nel senso della lunghezza per aprirlo completamente e osserva il numero e le dimensioni dei tumori nel colon-retto.
  6. Analisi patologica del colon-retto
    1. Fissare il colorectum in paraformaldeide al 4% per 24 h. Incorporare il tessuto rettale fisso in paraffina fusa e sezionarlo in modo continuo con uno spessore di 5 μm mediante un microtomo di congelamento dei tessuti.
    2. Secondo la procedura di Hou et al.24, decerare le sezioni in xilene e poi disidratarle con concentrazioni seriali di etanolo. Dopo aver colorato con una soluzione di ematossilina per 5 minuti, risciacquare le sezioni con acqua pura. Dopodiché, colorare con una soluzione di eosina allo 0,5% per 1 minuto (vedere la tabella dei materiali).
    3. Eseguire nuovamente la disidratazione a gradiente e il trattamento trasparente allo xilene. Sigillare le sezioni e osservarle al microscopio ottico (vedi Tabella dei materiali) e fotografare, come descritto da Xie et al.25.
  7. Analisi immunoistochimica del colon-retto
    1. Decerare e disidratare le sezioni secondo il metodo di cui sopra. Riparare l'antigene nelle sezioni con la tecnica di riparazione termica ad alta pressione, come descritto da Gok et al.26.
    2. Immergere le sezioni in bloccanti della perossidasi endogena a temperatura ambiente per 15 minuti. Sigillare le sezioni con siero di capra (vedi Tabella dei materiali).
    3. Aggiungere l'anticorpo primario ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) e KI67 (1:500; vedere la tabella dei materiali) alle sezioni e incubare per una notte a 4 °C. Risciacquare le sezioni con tampone PBS (vedere la tabella dei materiali), aggiungere l'anticorpo secondario per uso generale (1:5000; vedere la tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 30 min.
    4. Aggiungere la soluzione DAB (vedere la tabella dei materiali) alle sezioni per lo sviluppo del colore. Controcolorare le sezioni con una soluzione di ematossilina.
    5. Disidratare, rendere trasparenti e sigillare nuovamente le sezioni. Osservare l'espressione delle proteine al microscopio ottico.

Risultati

Il decotto di LJZD è stato preparato in base al rapporto di composizione dei farmaci nella Tabella 1 e al metodo di decotto della MTC nella Figura 1A. Secondo il punto temporale indicato nella Figura 1B, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 1 mg / mL di AOM il 7° giorno e i topi hanno avuto libero accesso all'acqua potabile contenente il 2% di DSS nella 3°, 6° e 9° settimana. I...

Discussione

Il CRC è uno dei tumori più comuni in tutto il mondo, con circa 1.148.000 nuovi casi e più di 576.000 decessi ogni anno. Il CRC può essere suddiviso in tre tipi in base a diverse cause, tra cui ereditario, sporadico e UC-CRC31. L'incidenza del CRC nei pazienti con malattie infiammatorie intestinali come la CU è significativamente superiore a quella della popolazione generale. La CU stimola lo sviluppo del CRC attraverso la via infiammatoria-cancro, che differisce dalla tipica via adenoma-aden...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia di Jilin (YDZJ202201ZYTS181).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AzoxymethaneSigmaA5486
5-amino salicylic acidKuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd3819413
C57BL/6J miceLiaoning Changsheng Biotechnology Co., LtdNO 210726210100853716
Cover slipJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
DAB color development kitJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd2005289
Dewatering machine Wuhan Junjie Electronics Co., LtdJJ-12J
Dextran sulfate sodiumDalian Meilun Biotechnology Co., LtdMB5535
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Hematoxylin-eosin dyeWuhan Hundred Degree Biotechnology Co., LtdB1000
IL-6Jiangsu Meimian Industrial Co., LtdMM-0163M2
IsofluraneRWD Life Science Co., LtdR510-22-10
KI67 primary antibodyGoogle Biotechnology IncGB121141
Neutral gumWuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd10004160
Object slideJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432A
Occludin primary antibodyAffnityDF7504
Orthostatic optical microscopeNikonNikon Eclipse CI
Pathological microtomeShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
ZO-1 primary antibodyAbcamab221547

Riferimenti

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