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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo fornece um modelo de camundongo de câncer colorretal ulcerativo associado à coloproctite induzido por azometano combinado com sulfato de sódio dextrana. O modelo foi utilizado para avaliar a eficácia de compostos da medicina tradicional chinesa na prevenção e tratamento do câncer colorretal.

Resumo

O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia maligna comum do sistema digestivo e tornou-se a terceira neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e a segunda causa de morte relacionada à malignidade. A coloproctite ulcerativa (RCU) é uma lesão pré-cancerosa, e o CCR associado à RCU (CCR-RCU) é o subtipo mais comum de CCR. Portanto, um modelo razoável de CCR-UC é a pedra angular e a garantia do desenvolvimento de novos fármacos. A medicina tradicional chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento do CCR-RCU devido à sua boa eficácia. Como prescrição tônica clássica da MTC, a decocção de Liujunzi (LJZD) tem sido amplamente utilizada no tratamento do CCR-RCU. Neste estudo, um modelo de CCR-RCU foi estabelecido pela combinação de azometano e sulfato de sódio dextrana e o LJZD foi administrado. Os dados confirmaram que o LJZD pode efetivamente inibir a transição do câncer no UC-CRC usando o peso corporal do rato, comprimento colorretal, fatores patológicos e inflamatórios, função da barreira colorretal e marcadores de câncer. Esse protocolo fornece um sistema de avaliação da eficácia da MTC na prevenção e tratamento do CCR-RCU.

Introdução

O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia maligna comum do trato gastrointestinal, a terceira neoplasia maligna mais comum e a segunda causa de morte mais comum no mundo, sendo responsável por 10% da incidência mundial de câncer e 9,4% do total de mortes relacionadas aocâncer1,2. Fatores genéticos, inflamação crônica, dieta rica em gordura, diabetes e flora intestinal anormal são fatores de risco para CCR 3,4. Dentre elas, a doença inflamatória intestinal, especialmente a coloproctite ulcerativa (RCU), é um claro fator de risco paraCCR5,6. O CCR associado à RCU (CCR-RCC) é um processo de transição de inflamação, hiperplasia atípica e câncer baseado na inflamação crônica do colorreto, que é diferente do modelo típico de desenvolvimento de adenoma-adenocarcinoma doCCR7,8. Comparado com a população geral, o risco de CCR é aproximadamente 10-40 vezes maior em pacientes com doença inflamatóriaintestinal9.

Atualmente, a cirurgia ainda é o tratamento padrão para o CCR e, dependendo da localização e do estágio do tumor, a radioterapia, a terapia medicamentosa sistêmica ou a combinação de ambos sãopossíveis10. Embora essas modalidades tradicionais de tratamento tenham feito grandes progressos, devido à alta heterogeneidade e taxa de recorrência do CCR, o prognóstico é ruim e o efeito do tratamento não é oideal11,12. Portanto, a detecção precoce, o diagnóstico precoce e o tratamento abrangente são fundamentais para melhorar a taxa de sobrevida dos pacientes com CCR, e é particularmente importante prestar atenção à transformação da RCU em CCR. Ao longo dos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) tem atraído muita atenção no tratamento do CCR-RCU ou gastrite crônica devido aos seus efeitos colaterais limitados e eficácia significativa. Com base no tratamento dialético, famosos praticantes da medicina chinesa de várias gerações criaram um grande número de prescrições clássicas, como a decocção Huangqi Jianzhong13, a decocção Sijunzi14 e a pílula Sishen15.

A decocção de Liujunzi (LJZD) originou-se dos trabalhos de Yi Xue Zheng Zhuan compilados na Dinastia Ming e é uma prescrição clássica na MTC16. Como mostrado na Tabela 1, LJZD consiste de seis ervas tradicionais, incluindo Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancão), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) e Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), que tem o efeito de repor o qi e fortalecer o baço, secar a umidade e resolver o catarro. Na prática clínica moderna, é frequentemente usado para tratar gastrite crônica, úlceras gástricas e úlceras duodenais. Pesquisas farmacológicas modernas têm demonstrado que o LJZD e o LJZD modificado têm alto valor de aplicação no tratamento adjuvante do câncer da RCU e do trato digestivo 17,18,19.

Atualmente, existem muitas maneiras de construir modelos de camundongos UC-CRC, mas o modelo de camundongo induzido por azoximetano (AOM)/dextran sulfato de sódio (DSS) é o modelo de UC-CRC mais amplamente utilizado; os sintomas clínicos, as observações morfológicas e patológicas comprovaram que o modelo é muito semelhante ao CCR-RCU humano20,21. O princípio básico é primeiro induzir a carcinogênese com AOM carcinogênico químico e, em seguida, expor continuamente camundongos ao ambiente de estimulação inflamatória da ESD para simular o dano contínuo e o reparo do epitélio da mucosa intestinal, construindo assim um modelo de camundongo UC-CRC22. O objetivo deste estudo é estabelecer um modelo murino de CCR-RCC por injeção intraperitoneal de OMA e estimulação cíclica de ESD em curto prazo e avaliar o efeito da droga e do mecanismo molecular do LJZD no CCR-RCU, a fim de fornecer uma base científica para o tratamento do CCR-RCU.

Protocolo

O procedimento animal foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (Número de registro: 2021214). Camundongos C57BL/6J livres de patógenos específicos (8-10 semanas, peso 18-22 g), machos e fêmeas, foram alojados em gaiolas ventiladas independentemente a 22 °C e 65% de umidade relativa. Os camundongos iniciaram o experimento após 7 dias de alimentação adaptativa, durante os quais tiveram livre acesso à água e à dieta.

1. Preparação de medicamentos

  1. Preparação do LJZD
    NOTA: O medicamento chinês utilizado foi adquirido ao Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun e foi identificado como medicina chinesa genuína (ver Tabela 1).
    1. Coloque Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) em um pote de cerâmica especializado (ver Tabela de Materiais). Adicionar 1000 ml de água destilada e deixar de molho à temperatura ambiente durante 1 h (ver figura 1A).
    2. Pó 12 g Encher em pó fino com um moedor e mergulhar em 300 mL de água destilada em outro recipiente por 1 h à temperatura ambiente.
    3. Misture a medicina chinesa acima no pote de cerâmica especializado. Ferva a mistura e depois mantenha em fogo médio até restar apenas 300 mL de decocção. Use gaze médica para filtrar e preservar o filtrado à temperatura ambiente.
    4. Adicionar 1000 mL de água destilada e repetir a operação de decocção acima mais uma vez. Filtre novamente usando gaze médica. Combine o filtrado e ferva até restarem apenas 150 mL.
    5. Centrifugar o líquido concentrado a 10.000 x g por 5 min e concentrar o sobrenadante obtido a 30 mL em fogo médio. Transfira o concentrado final para um prato e seque-o em estufa de secagem elétrica até que reste apenas o soluto em pó.
    6. Pesar o sólido acima e dissolvê-lo em água destilada estéril para obter uma solução contendo 22,85 mg de droga por 0,2 mL (114,16 mg/mL), que é a dose diária de camundongos.
  2. Preparação de ácido 5-amino salicílico
    NOTA: O ácido 5-amino salicílico (5-AAS; ver Tabela de Materiais) tem um bom efeito preventivo na RCU-CCR, e foi usado como droga positiva neste estudo23.
    1. Dissolver 64 mg de pó de 5-ASA em 200 mL de água destilada estéril para obter 1,82 mg/mL de solução de 5-AAS. A dose diária para um único camundongo foi de 0,2 mL.
  3. Preparação da solução injetável de AOM
    1. Adicionar 2,5 ml de água destilada estéril em pó de AOM 25 mg (ver Tabela de Materiais) e misturar por misturador de vórtice (ver Tabela de Materiais) para fazer 10 mg/ml de solução-mãe de AOM, conservar a -20 °C até à utilização.
    2. Preparar a solução de injeção de AOM diluindo a solução-mãe de AOM com água destilada estéril a 10:1 (1 mg/mL).

2. Estabelecimento do modelo UC-CRC

OBS: O experimento foi dividido em 4 grupos: controle, modelo, LJZD e grupo 5-ASA, sendo 10 camundongos em cada grupo. Com exceção do grupo controle, os demais grupos foram tratados com OMA e ESD.

  1. Injeção intraperitoneal de solução injetável de AOM
    NOTA: Após alimentação adaptativa para 7 d, os camundongos receberam solução de injeção de AOM (1 mg/mL) por injeção intraperitoneal (ver Figura 1B).
    1. Segure o mouse com a barriga para cima e a cabeça levemente para baixo. Segure a pele posterior para apertar a pele abdominal e perfure a pele aproximadamente 1 cm à direita da intersecção da linha da raiz de ambas as coxas na linha média do abdome com uma seringa de 1 mL (ver Tabela de Materiais).
    2. Empurre a agulha de seringa de 1 mL para uma distância de 3-5 mm sob a pele, mantendo-a paralela à linha média abdominal, e insira a agulha 0,3-0,5 mm na cavidade abdominal a 45°.
    3. Depois que a ponta passa pelo músculo abdominal, o operador sente uma perda súbita de resistência. Em seguida, puxe a seringa para fora e para trás para observar se ocorre infiltração de líquido. Caso contrário, empurre a solução de injeção de AOM lentamente para os ratos a 0,1 mL/10 g.
  2. Estimulação cíclica da solução de DSS a 2%
    NOTA: Cada camundongo induzido por OMA recebeu 500 mL de solução de DSS nas semanas 3, 6 e 9, e os camundongos beberam livremente durante esse período.
    1. Preparar a solução de DSS a 2% adicionando 500 ml de água destilada estéril a 10 g de DSS (ver Tabela de Materiais). Misture com um misturador de vórtices e conservar a 4 °C até à utilização.
    2. Cada camundongo induzido por OMA bebe livremente 500 mL de solução de DSS a 2% por 7 dias nas semanas 3, 6 e 9 após a indução com OMA.

3. Tratamento medicamentoso

NOTA: Humanos adultos precisam de 63 g de LJZD por dia. De acordo com a fórmula de conversão de dose experimental de camundongos e drogas humanas, dose experimental equivalente para camundongos (mg/kg) = dose humana (mg/kg)/peso corporal (60 kg) x 9,1, a dose diária de camundongos foi de cerca de 9,6 g/kg.

  1. Tratar o grupo LJZD e 5-ASA com 0,1 mL/10 g da solução preparada de LJZD e 5-AAS por gavagem gástrica na semana 7 e na semana 15, respectivamente.
    1. Para administração intragástrica em camundongos, execute o seguinte procedimento. Segure o mouse na mão esquerda e, na mão direita, segure o aparelho de perfusão do estômago. Insira a agulha da seringa na boca e deslize-a pela parede posterior da faringe dos ratos. Deslize pela faringe enquanto os ratos engolem e continuam a avançar. Quando houvesse uma sensação de resistência, e a seringa pudesse ser empurrada para dentro da faringe, puxe a agulha para fora e complete a injeção.
  2. Tratar o grupo controle e modelo com a mesma quantidade de soro fisiológico (ver Tabela de Materiais).
  3. Trate os ratos em cada grupo com droga apropriada uma vez por dia à mesma hora durante o período de administração.

4. Avaliação do modelo de CCR-RCU e eficácia do LJZD

  1. Escore do índice de atividade da doença
    NOTA: De acordo com a Tabela 2, o escore do índice de atividade da doença (DAI) foi avaliado pela combinação de perda de peso, viscosidade fecal e sangramento fecal dos camundongos.
    1. Registre o peso dos camundongos diariamente desde o início da alimentação adaptativa até o final do tratamento medicamentoso.
    2. Observe cuidadosamente a consistência fecal de cada camundongo experimental e registre os movimentos intestinais como uma das três condições: fezes normais, soltas e diarreia aquosa.
    3. Registrar o sangramento fecal dos animais experimentais como uma das três condições: sem sangramento, pouco sangramento e sangue visível nas fezes.
  2. Detecção do nível de IL-6 no soro
    1. Trate camundongos com LJZD ou 5-ASA por 9 semanas. Fixe os ratos segurando a pele do pescoço do rato com a mão esquerda e pressionando suavemente a mesa experimental para assumir a posição de decúbito lateral. Corte os bigodes dos ratos com uma tesoura. Corte cuidadosamente os bigodes dos ratinhos com uma tesoura (ver Tabela de Materiais) para evitar a contaminação do sangue.
      NOTA: Os ratos que não conseguiam mexer livremente foram considerados devidamente fixados. Se isso não acontecer, os ratos devem ser fixados.
    2. Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano a 2%. Esterilizar a pele ao redor do globo ocular com etanol (ver Tabela de Materiais). Pressione a pele dos olhos do lado suavemente para deixar o globo ocular congestionado e saliente.
    3. Aperte o globo ocular com uma pinça de cotovelo e remova os globos oculares com precisão e rapidez. Deixe o sangue escorrer para o tubo centrífugo (ver Tabela de Materiais). No processo, toque no coração do mouse para acelerar a coleta de sangue.
    4. Manter o sangue coletado em temperatura ambiente por 30 min e centrifugar a 3.500 x g por 10 min. Coletar o sobrenadante e detectar o nível de IL-6 de acordo com as instruções do kit de detecção de conteúdo IL-6 (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Separando o tecido colorretal
    1. Eutanasiar os camundongos após a coleta de sangue inalando isoflurano com overdose de 5% e deslocamento cervical (ver Tabela de Materiais) de acordo com a ética animal.
    2. Manter os camundongos em um ambiente anatômico criogênico. Imobilizar os camundongos em decúbito dorsal. Corte os pelos da parte inferior do abdômen com tesoura e esterilize-os com etanol.
    3. Aperte o ponto de intersecção entre as duas raízes da coxa e a linha média abdominal com pinça palpebral (ver Tabela de Materiais). Corte uma incisão transversal de cerca de 1-1,5 cm com tesoura.
    4. Clipar uma incisão longitudinal ao longo da linha mediana do abdome a partir do ponto médio da incisão transversal em direção ao processo xifoide.
    5. Remova os tecidos pericolorretais na direção do ânus para separar o colorreto do tecido circundante. Tenha cuidado para não danificar o colorreto.
    6. Empurre a pele do abdômen para os lados para expor totalmente o colorreto. Remova o colorreto da cavidade abdominal com pinça palpebral e corte os segmentos do ânus ao ceco (excluindo); O comprimento total é de cerca de 10 cm. Armazenar os tecidos colorretais obtidos em solução salina a 4 °C.
  4. Avaliação do comprimento e peso do reto
    1. Extrair o soro fisiológico a 4 °C com uma agulha de 5 ml (ver Tabela de Materiais) para lavar o interior do colorretal. Em seguida, coloque o colorreto sobre papel absorvente para absorver a umidade do tecido.
    2. Pese os tecidos colorretais e, em seguida, coloque-os em papel A4 para medir seu comprimento.
  5. Medir o número de tumores no colorreto
    1. Corte o colorreto longitudinalmente para desdobrá-lo completamente e observe o número e o tamanho dos tumores no colorreto.
  6. Análise patológica do colorreto
    1. Fixar o colorreto em paraformaldeído a 4% por 24 horas. Embutir o tecido retal fixado em parafina derretida e cortar continuamente com uma espessura de 5 μm por um micrótomo de congelamento de tecido.
    2. De acordo com o procedimento de Hou et al.24, desparafinar os cortes em xileno e desidratá-los com concentrações seriadas de etanol. Após coloração com solução de hematoxilina por 5 min, enxaguar os cortes com água pura. Depois disso, corar com solução de eosina a 0,5% por 1 minuto (ver Tabela de Materiais).
    3. Realizar novamente a desidratação do gradiente e o tratamento transparente com xileno. Selar os cortes e observá-los ao microscópio óptico (ver Tabela de Materiais) e fotografar, conforme descrito por Xie et al.25.
  7. Análise imunoistoquímica do colorreto
    1. Despifilar e desidratar as seções de acordo com o método acima. Reparar o antígeno nos cortes com técnica de reparo térmico a alta pressão, conforme descrito por Gok et al.26.
    2. Mergulhe os cortes em bloqueadores de peroxidase endógena à temperatura ambiente por 15 min. Selar as secções com soro de cabra (ver Tabela de Materiais).
    3. Adicione o anticorpo primário ZO-1 (1:1000), Occludina (1:1000) e KI67 (1:500; ver Tabela de Materiais) às seções e incube durante a noite a 4 °C. Enxaguar as secções com tampão PBS (ver Tabela de Materiais), adicionar anticorpo secundário de uso geral (1:5000; ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante 30 minutos.
    4. Adicione a solução DAB (consulte Tabela de materiais) às seções para desenvolvimento de cores. Contramanchar os cortes com solução de hematoxilina.
    5. Desidrate, transparente e sele as seções novamente. Observar a expressão da proteína pelo microscópio óptico.

Resultados

A decocção do LJZD foi preparada de acordo com a proporção de composição dos fármacos na Tabela 1 e o método de decocção da MTC na Figura 1A. De acordo com o momento indicado na Figura 1B, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 1 mg/mL de AOM no7º dia, e os camundongos tiveram livre acesso à água potável contendo 2% de DSS na3ª,6ª e9ª semanas. O modelo de camundongo UC...

Discussão

O CCR é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo, com aproximadamente 1.148.000 novos casos e mais de 576.000 mortes a cada ano. O CCR pode ser dividido em três tipos de acordo com diferentes causas, incluindo hereditárias, esporádicas e RCU-CCR31. A incidência de CCR em pacientes com doenças inflamatórias intestinais, como a RCU, é significativamente maior do que na população geral. A RCU estimula o desenvolvimento do CCR através da via inflamatória-neoplásica, que difere da via ...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento Provincial de Ciência e Tecnologia de Jilin (YDZJ202201ZYTS181).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AzoxymethaneSigmaA5486
5-amino salicylic acidKuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd3819413
C57BL/6J miceLiaoning Changsheng Biotechnology Co., LtdNO 210726210100853716
Cover slipJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
DAB color development kitJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd2005289
Dewatering machine Wuhan Junjie Electronics Co., LtdJJ-12J
Dextran sulfate sodiumDalian Meilun Biotechnology Co., LtdMB5535
Embedding machineWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Hematoxylin-eosin dyeWuhan Hundred Degree Biotechnology Co., LtdB1000
IL-6Jiangsu Meimian Industrial Co., LtdMM-0163M2
IsofluraneRWD Life Science Co., LtdR510-22-10
KI67 primary antibodyGoogle Biotechnology IncGB121141
Neutral gumWuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd10004160
Object slideJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432A
Occludin primary antibodyAffnityDF7504
Orthostatic optical microscopeNikonNikon Eclipse CI
Pathological microtomeShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
ZO-1 primary antibodyAbcamab221547

Referências

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