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  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati Rappresentativi
  • Discussione
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  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive una procedura per la stampa tridimensionale (3D) di colonie batteriche per studiarne la motilità e la crescita in complesse matrici di idrogel poroso 3D che sono più simili ai loro habitat naturali rispetto alle colture liquide convenzionali o alle piastre di Petri.

Abstract

I batteri sono onnipresenti in ambienti porosi tridimensionali complessi (3D), come tessuti biologici e gel, suoli e sedimenti sotterranei. Tuttavia, la maggior parte del lavoro precedente si è concentrata sugli studi di cellule in liquidi sfusi o su superfici piane, che non ricapitolano completamente la complessità di molti habitat batterici naturali. Qui, questa lacuna di conoscenza viene affrontata descrivendo lo sviluppo di un metodo per stampare in 3D dense colonie di batteri in matrici di idrogel granulare inceppate. Queste matrici hanno dimensioni dei pori regolabili e proprietà meccaniche; confinano fisicamente le cellule, supportandole così in 3D. Sono otticamente trasparenti, consentendo la visualizzazione diretta della diffusione batterica nell'ambiente circostante utilizzando l'imaging. A riprova di questo principio, la capacità di questo protocollo è dimostrata dalla stampa 3D e dall'imaging di Vibro cholerae non mobili e mobili, nonché di Escherichia coli non mobili, in matrici di idrogel granulare inceppate con diverse dimensioni dei pori interstiziali.

Introduzione

I batteri spesso abitano ambienti porosi 3D diversi e complessi che vanno dai gel di mucosa nell'intestino e nei polmoni al suolo nel terreno 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20,21,
22,23,24,25. In questi contesti, il movimento batterico attraverso la motilità o la crescita può essere ostacolato da ostacoli circostanti, come reti polimeriche o impacchettamenti di granuli minerali solidi, che influenzano la capacità delle cellule di diffondersi attraverso i loro ambienti26, accedere a fonti di nutrienti, colonizzare nuovi terreni e formare comunità di biofilm protettivi27. Tuttavia, gli studi di laboratorio tradizionali impiegano in genere geometrie altamente semplificate, concentrandosi su cellule in colture liquide o su superfici piane. Sebbene questi approcci forniscano informazioni chiave sulla microbiologia, non ricapitolano completamente la complessità degli habitat naturali, portando a differenze drammatiche nei tassi di crescita e nel comportamento della motilità rispetto alle misurazioni eseguite in contesti reali. Pertanto, è assolutamente necessario un metodo per definire le colonie batteriche e studiarne la motilità e la crescita in ambienti porosi 3D più simili a molti dei loro habitat naturali.

L'inoculazione di cellule in un gel di agar e quindi la visualizzazione della loro diffusione macroscopica a occhio o utilizzando una macchina fotografica fornisce un modo semplice per raggiungere questo obiettivo, come proposto per la prima volta da Tittsler e Sandholzer nel 193628. Tuttavia, questo approccio soffre di una serie di sfide tecniche chiave: (1) Mentre le dimensioni dei pori possono, in linea di principio, essere variate variando la concentrazione di agarosio, la struttura dei pori di tali gel è scarsamente definita; (2) La diffusione della luce fa sì che questi gel siano torbidi, rendendo difficile la visualizzazione delle cellule su scala individuale con alta risoluzione e fedeltà, in particolare in campioni di grandi dimensioni; (3) Quando la concentrazione di agar è troppo grande, la migrazione cellulare è limitata alla superficie piana superiore del gel; (4) La complessa reologia di tali gel rende difficile l'introduzione di inoculi con geometrie ben definite.

Per affrontare queste limitazioni, in un lavoro precedente, il laboratorio di Datta ha sviluppato un approccio alternativo utilizzando matrici di idrogel granulare - composte da particelle di idrogel inceppate e biocompatibili gonfiate in coltura batterica liquida - come "piastre di Petri porose" per confinare le cellule in 3D. Queste matrici sono solidi morbidi, autorigeneranti, con tensione di snervamento; quindi, a differenza dei gel reticolati utilizzati in altri processi di bioprinting, un microugello di iniezione può muoversi liberamente all'interno della matrice lungo qualsiasi percorso 3D prescritto riorganizzando localmente le particelle di idrogel29. Queste particelle si ridensificano rapidamente e si auto-riparano intorno ai batteri iniettati, supportando le cellule in posizione senza ulteriori trattamenti dannosi. Questo processo è, quindi, una forma di stampa 3D che consente di disporre le cellule batteriche - in una struttura 3D desiderata, con una composizione di comunità definita - all'interno di una matrice porosa con proprietà fisico-chimiche regolabili. Inoltre, le matrici di idrogel sono completamente trasparenti, consentendo di visualizzare direttamente le cellule tramite imaging.

L'utilità di questo approccio è stata dimostrata in precedenza in due modi. In una serie di studi, le cellule diluite sono state disperse in tutta la matrice di idrogel, il che ha permesso di studiare la motilità dei singoli batteri30,31. In un'altra serie di studi, le comunità multicellulari sono state stampate in 3D in gel su scala centimetrica utilizzando un ugello di iniezione montato su un tavolino da microscopio programmabile, che ha consentito studi sulla diffusione di collettivi batterici attraverso l'ambientecircostante 32,33. In entrambi i casi, questi studi hanno rivelato differenze precedentemente sconosciute nelle caratteristiche di diffusione dei batteri che abitano ambienti porosi rispetto a quelli in coltura liquida/su superfici piane. Tuttavia, dato che erano montati su un tavolino da microscopio, questi studi precedenti erano limitati a piccoli volumi di campione (~ 1 mL) e, quindi, a brevi scale temporali sperimentali. Erano anche limitati nella loro capacità di definire geometrie di inoculi con un'alta risoluzione spaziale.

Qui viene descritta la prossima generazione di questa piattaforma sperimentale che affronta entrambe le limitazioni. In particolare, vengono forniti protocolli in base ai quali è possibile utilizzare una stampante 3D modificata con un estrusore di siringa collegato per stampare in 3D e visualizzare colonie batteriche su larga scala. Inoltre, dati rappresentativi indicano come questo approccio possa essere utile per studiare la motilità e la crescita dei batteri, utilizzando come esempi il Vibrio cholerae e l'Escherichia coli planctonici. Questo approccio consente di sostenere le colonie batteriche per lunghi periodi di tempo e di visualizzarle utilizzando varie tecniche di imaging. Quindi, la capacità di questo approccio di studiare le comunità batteriche in habitat porosi 3D ha un enorme potenziale di ricerca e applicato, influenzando il trattamento e lo studio dei microbi nell'intestino, nella pelle, nel polmone e nel suolo. Inoltre, questo approccio potrebbe essere utilizzato in futuro per la stampa 3D di materiali viventi ingegnerizzati a base di batteri in forme autoportanti più complesse.

Protocollo

Questo approccio consiste nel convertire una stampante commerciale per la modellazione a deposizione fusa 3D in una biostampante 3D utilizzando un protocollo precedentemente stabilito da Tashman et al.34. In breve, Tashman et al. hanno sostituito una testa di estrusione commerciale con un estrusore a pompa a siringa su misura. Questo estrusore consente la stampa in 3D di sospensioni liquide altamente concentrate di cellule batteriche, con il suo volume estruso e la posizione 3D controllati dal linguaggio di programmazione G-code. Il volume estruso è specificato nel software dalla fase dell'estrusore (E-step) e viene ulteriormente calibrato come descritto di seguito. Queste sospensioni batteriche vengono quindi stampate direttamente in una matrice granulare di idrogel, che funge da supporto 3D per le cellule. Di seguito, il protocollo descrive anche come preparare matrici con diverse concentrazioni di polimeri, caratterizzare i cambiamenti risultanti nella dimensione dei pori e nelle proprietà reologiche e caratterizzare la successiva motilità e crescita batterica utilizzando l'imaging diretto.

1. Conversione di una stampante 3D commerciale in una biostampante 3D

  1. Rimuovere l'estrusore e il riscaldatore da una stampante 3D commerciale (vedere la tabella dei materiali).
  2. Seguire i protocolli precedenti per fabbricare l'estrusore della pompa a siringa34, con un'ulteriore modifica per ospitare una siringa Luer lock monouso. Montare l'estrusore della pompa a siringa sulla stampante.
    NOTA: I file CAD necessari per la modifica dell'estrusore della pompa a siringa per siringhe in plastica sono forniti nei file supplementari 1-3.
  3. Installare e aprire il software della stampante 3D (vedere Tabella dei materiali) su un computer. Collegare la stampante 3D al computer.
  4. Caricare una siringa monouso da 1 mL con un ago di dimensioni adeguate nei morsetti stampati in 3D allineando le metà superiore e inferiore del meccanismo (Figura 1). Fissare i morsetti attorno alla siringa utilizzando tre bulloni a brugola M8 e dadi esagonali sottili in acciaio (vedere la tabella dei materiali). Lo stantuffo della siringa si collega con la vite di comando nell'estrusore della pompa della siringa. Sollevare manualmente lo stantuffo ruotando la vite di comando per creare un traferro di 0,5 mL nella siringa.
  5. Se la contaminazione è un problema per l'esperimento, trasportare il complesso siringa-pinza in una biocappa e sterilizzare con etanolo spray al 70% all'ingresso prima di completare i passaggi successivi.

2. Preparazione della sospensione batterica

  1. Per V. cholerae ed E. coli, coltivare durante la notte su una piastra di agar Lennox LB (Luria Broth, vedi Tabella dei materiali) al 2% a 37 °C.
    1. Per V. cholerae, inoculare le cellule in 3 mL di LB liquido con dieci perle di vetro sterili. Far crescere le cellule in un incubatore agitato a 37 °C per 5-6 ore fino alla fase esponenziale media fino a una densità ottica (OD) 600 di ~0,9.
    2. Per E. coli, inoculare le cellule in 3 mL di LB liquido. Far crescere le cellule in un'incubatrice agitata a 37 °C per una notte. Inoculare 200 μL della coltura notturna in LB fresco per 3 ore fino a quando la OD raggiunge 0,6.
  2. Trasferire la coltura in una provetta da centrifuga da 10 ml. Centrifugare la coltura per 5 minuti a 5.000 x g a temperatura ambiente per formare un pellet. Rimuovere il surnatante. Risospendere con ~10 μL di LB liquido per ottenere una densità cellulare di ~9 x 1010 cellule per mL.

3. Caricamento della sospensione batterica nella siringa

NOTA: Sono disponibili due metodi per caricare i batteri nella siringa (passaggio 3.1 e passaggio 3.2). La fase 3.1 funziona per il caricamento di piccoli volumi di sospensioni batteriche, <200 μL, e la fase 3.2 funziona per il caricamento di volumi maggiori di sospensioni batteriche, >200 μL. La fase 3.1 è stata utilizzata per i risultati rappresentativi mostrati qui.

  1. Caricare una siringa Luer lock in plastica vuota da 1 mL nella biostampante 3D. Collegare lo stantuffo della siringa con la vite di comando. Ritrarre manualmente la siringa per aggiungere 0,2 mL di traferro per fornire spazio allo stantuffo per muoversi nella siringa poiché viene utilizzato un piccolo volume di cellule ~20-50 μL per ogni lotto di esperimenti.
    1. Applicare un ago smussato alla punta della siringa con la dimensione dell'ago necessaria per le dimensioni delle caratteristiche di stampa richieste. Qui viene utilizzato un ago da 20 G da 2 pollici.
    2. Caricare la sospensione batterica nella siringa posizionando una provetta da centrifuga da 10 ml con l'inoculo batterico sotto l'ago. Ruotare manualmente la vite per ritrarre lo stantuffo della siringa e caricare le cellule nella siringa. I volumi delle cellule batteriche sono così piccoli che spesso le cellule vengono caricate solo nell'ago.
  2. Rimuovere lo stantuffo dal complesso siringa-pinza e utilizzare un'altra siringa e un ago per caricare con cura il complesso siringa-pinza con le sospensioni batteriche desiderate, facendo attenzione a non intrappolare le bolle d'aria. Il complesso siringa-pinza deve essere riempito leggermente oltre l'orlo con la sospensione batterica desiderata e quindi trasferito alla biostampante.
    1. Inserire con cautela il complesso siringa-pinza senza lo stantuffo nella presa corrispondente sul nucleo principale dell'estrusore per biostampante.
    2. Assicurarsi che il carrello della stampante si trovi circa a metà della vite di comando e che sia presente un piatto di raccolta sotto la siringa carica. Quindi, inserire con cautela lo stantuffo attraverso il carrello e il complesso siringa-pinza finché non si impiglia nel carrello. Premere lentamente lo stantuffo nella sospensione batterica per evitare di intrappolare le bolle d'aria nella siringa.
    3. Far scorrere l'adattatore clamp sul carrello sopra la parte posteriore dello stantuffo per fissarlo in posizione sia per le manovre di estrusione che di retrazione.

4. Calibrazione del passo dell'estrusore al volume depositato

  1. Per calibrare la fase dell'estrusore (E-step) in base al volume depositato, impostare prima la biostampante con la siringa, l'ago della siringa e la sospensione batterica di deposito esatti che verranno utilizzati nell'esperimento. In questo caso, viene utilizzata una siringa Luer lock da 1 mL.
  2. Determinare un intervallo stimato di E-step da calibrare estrudendo un numero arbitrario di E-step (~200) e annotare la variazione del volume dello stantuffo con i marcatori del volume della siringa.
  3. Utilizzare questo rapporto grossolano tra E-step e volume per determinare le impostazioni E-step per eseguire lo sweep di calibrazione. Ad esempio, se un passo E di 200 estrude circa 20 μL mediante ispezione visiva e si desidera depositare 10-200 μL, testare i passi E tra 100 e 2000.
  4. Per eseguire lo sweep di calibrazione lineare, etichettare prima e misurare la massa secca di venti provette di campionamento da 1,5 mL su una bilancia analitica con sensibilità di 0,1 mg.
  5. Estrudere la sospensione batterica nelle provette da 1,5 mL predosate. Per ogni E-step, eseguire almeno 2 repliche. Ripetere l'operazione per tutti i passi E nell'intervallo lineare, sostituendo la sospensione batterica se necessario. Se la contaminazione è un problema per l'esperimento, pulire l'esterno dell'ago della siringa con un panno privo di lanugine imbevuto di etanolo al 70% dopo ogni campione.
  6. Misurare la massa di tutte le provette da 1,5 mL con la stessa bilancia analitica. Sottrarre il primo valore di massa dal secondo per ottenere una massa netta di sospensione batterica depositata.
  7. Convertire la massa della sospensione batterica in un volume con la densità del materiale. Per molte sospensioni batteriche composte principalmente da acqua, 1 g/mL è un'approssimazione di densità appropriata.
  8. Eseguire un accoppiamento lineare tra il passo E e il volume estruso per completare il processo di calibrazione.

5. Preparazione della matrice granulare di idrogel

  1. In una cabina di biosicurezza, aggiungere granuli secchi di copolimeri di acido acrilico/alchilacrilato reticolato (vedi tabella dei materiali) a 400 mL di Lennox Luria-Bertani (LB) al 2% per mantenere sterile la matrice; Tuttavia, è possibile utilizzare anche altri terreni di coltura cellulare liquidi per gonfiare la matrice di idrogel.
    NOTA: La percentuale in peso di granuli aggiunti al LB dipende dalla dimensione dei pori a cui si mira. Nel presente studio, per una matrice di idrogel granulare allo 0,9%, vengono aggiunti 3,6 g di granuli secchi al LB e per una matrice di idrogel granulare all'1,2%, vengono aggiunti 4,8 g di granuli secchi al LB. I granuli di idrogel vengono dispersi in modo omogeneo mescolandoli in un robot da cucina per 2 min.
  2. Una volta miscelato, regolare il pH a 7,4 aggiungendo incrementi da 20 a 500 μL di idrossido di sodio (NaOH) 10 M per garantire la vitalità cellulare. Dopo ogni aggiunta di NaOH, misurare il pH immergendo il puntale di una pipetta nella miscela e quindi strofinando la matrice di idrogel su una carta per il test del pH.
    NOTA: Man mano che viene aggiunto il NaOH, la viscosità della miscela aumenterà man mano che i granuli di idrogel inizieranno a gonfiarsi. I granuli di idrogel gonfi hanno un diametro compreso tra ~ 5 μm e 10 μm e sono incastrati insieme in una matrice di idrogel. La dimensione interna delle maglie dei granuli è compresa tra ~40 nm e 100 nm, come stabilito in precedenza32. La dimensione della maglia è abbastanza grande da consentire alle piccole molecole (ad esempio, ossigeno e sostanze nutritive) di diffondersi liberamente, ma abbastanza piccola da consentire ai batteri di essere confinati tra i pori interstiziali.
  3. Successivamente, trasferire la matrice di idrogel granulare in una provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando una siringa di plastica sterile da 50 mL. Centrifugare la matrice di idrogel a 161 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per rimuovere le bolle che si formano durante il processo di miscelazione.
  4. Lasciare riposare la matrice di idrogel per almeno 2 giorni a temperatura ambiente per garantire che non si sia verificata alcuna contaminazione. La contaminazione si presenta come microcolonie sospese nella matrice di idrogel. Dopo due giorni, centrifugare la matrice di idrogel a 161 x g per 1 minuto per rimuovere eventuali bolle aggiuntive che si sono formate.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui conservando la matrice di idrogel a temperatura ambiente per un massimo di una settimana.
  5. Nell'armadio di biosicurezza, utilizzando una siringa di plastica sterile da 30 mL, trasferire la quantità desiderata di matrice di idrogel nel contenitore in cui avverrà la stampa (in questo caso sono stati utilizzati ~20 mL per un pallone di coltura tissutale da 20 mL o 1 mL per micro cuvette di plastica da 1 mL).

6. Caratterizzazione delle proprietà reologiche della matrice granulare di idrogel

  1. Caricare ~3 mL della matrice di idrogel in un reometro a taglio (vedi Tabella dei materiali) con uno spazio di 1 mm tra le piastre parallele ruvide di 50 mm di diametro per misurare le proprietà reologiche.
  2. Quantificare il comportamento di snervamento utilizzando misurazioni di taglio unidirezionali sul reometro di taglio misurando la sollecitazione di taglio in funzione di una scansione logaritmica della velocità di taglio da 10-4 s-1 a 102 s-1 (ad esempio, Figura 2A).
    NOTA: A basse velocità di taglio, la matrice di idrogel avrà una sollecitazione di taglio costante (la tensione di snervamento) indipendente dalla velocità di taglio. A velocità di taglio elevate, lo sforzo di taglio aumenterà con una dipendenza della legge di potenza dalla velocità di taglio, indicando la fluidificazione della matrice di idrogel. Questo comportamento di snervamento-stress consente ai batteri di essere stampati in 3D all'interno della matrice granulare di idrogel29.
  3. Misurare i moduli di immagazzinamento e perdita, rispettivamente G' e G'', in funzione della frequenza utilizzando la reologia oscillatoria di piccola ampiezza con un'ampiezza di deformazione dell'1% e frequenze comprese tra 0,1 e 1 Hz (ad esempio, Figura 2B).
    NOTA: La matrice di idrogel granulare ideale per la stampa 3D dovrebbe avere un modulo di accumulo maggiore del modulo di perdita, il che indica che il mezzo agisce come un solido elastico inceppato29.

7. Caratterizzazione della dimensione dei pori interstiziali della matrice granulare di idrogel

  1. Sonicare nanoparticelle di polistirene fluorescente carbossilato da 100 nm (~3,6 x 1013 particelle/mL, vedere la tabella dei materiali) nella loro confezione per 15 minuti per risospendere e rompere eventuali aggregazioni/cluster di particelle. Trasferire 50 μL di nanoparticelle in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
    1. Centrifugare per 10 minuti a 9.500 x g a temperatura ambiente fino a quando il pellet non si forma e il surnatante è limpido. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL del terreno di coltura liquido (qui LB) utilizzato per preparare la matrice granulare di idrogel.
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui conservando le nanoparticelle risospese a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  2. Sonicare le nanoparticelle risospese per 30 min. Trasferire 1 mL di matrice di idrogel granulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 1 μL di nanoparticelle risospese alla matrice granulare di idrogel e mescolarle con un puntale per pipetta. Dopo la miscelazione, centrifugare per 30 s a 161 x g a temperatura ambiente.
  3. Trasferire la matrice di idrogel e la miscela di nanoparticelle in una capsula di Petri di 35 mm di diametro con un pozzetto di vetro di 0,1 mm di spessore. Il pozzo ha un diametro di 20 mm e una profondità di 1 mm. Posizionare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore e premere verso il basso per disabilitare il flusso e l'evaporazione durante l'imaging. Un'alternativa al vetrino coprioggetto è aggiungere 1 ml di olio di paraffina sulla parte superiore.
  4. Immagine delle nanoparticelle utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo a olio 40x con zoom aggiuntivo 8x nel software di imaging (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: È possibile utilizzare un obiettivo con un ingrandimento maggiore invece di utilizzare uno zoom digitale aggiuntivo nel software.
    1. Immagine di un loop temporale senza ritardo (idealmente ~19 fotogrammi/s) in un singolo piano z per 2 minuti con almeno quattro nanoparticelle all'interno del campo visivo. Ripeti da 15 a 20 volte in luoghi diversi per raccogliere dati sufficienti per le statistiche (da 100 a 200 nanoparticelle).
  5. Utilizzare un software di tracciamento delle particelle per analizzare lo spostamento delle particelle. In questo caso, viene utilizzato uno script personalizzato basato sul classico algoritmo di Crocker-Grier per tracciare il centro di massa della nanoparticella35 (vedi File supplementare 7).
    1. Dal tracciamento delle particelle, calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD). L'MSD mostrerà una diffusione libera nello spazio dei pori a brevi lunghezze e scale temporali e la transizione alla scalatura sub-diffusiva a grandi lunghezze e scale temporali a causa del confinamento35.
  6. Identificare la scala di lunghezza in cui si verifica la transizione al ridimensionamento subdiffusivo per stimare la dimensione locale dei pori. Calcola la dimensione dei pori aggiungendo questa scala di lunghezza al diametro delle nanoparticelle. Ripetere l'analisi della dimensione dei pori per ogni nanoparticella misurata. Ciò produrrà una distribuzione delle dimensioni dei pori da cui è possibile calcolare una dimensione media dei pori (ad esempio, Figura 3).

8. 3D processo di stampa

  1. Stampa in 3D supporti su misura per i contenitori dei campioni (vedi File supplementari 4-6 per i file CAD). In questo caso vengono utilizzati i supporti per i palloni di coltura tissutale e le microcuvette. I supporti consentono di programmare la stampante per stampare più campioni in un'unica sessione di stampa. Posiziona i contenitori dei campioni con il terreno idrogel nei supporti sulla piattaforma di stampa.
  2. Apri il software di stampa 3D. Caricare un g-code pre-programmato nel software. Per i risultati rappresentativi, il passaggio 3.1 viene utilizzato per caricare la sospensione batterica nella stampante 3D.
    NOTA: Un esempio di codice g per la stampa di geometrie verticali lineari è riportato nella Tabella 1.
  3. Tramite il software di stampa 3D, sposta i piani x-y-z per centrare la testina di stampa sul piano x-y in modo che sia il primo contenitore e quindi a casa dell'asse z. L'asse Z di homing solleverà la testina di stampa. Ruotare manualmente lentamente la vite per premere lo stantuffo della siringa fino a quando non si vede una piccola quantità di sospensione batterica sulla punta dell'ago.
    1. Rimuovere leggermente la sospensione batterica in eccesso con una salvietta sterile monouso. In base all'altezza del portacampione, dell'ago e della siringa, utilizzando il software di stampa 3D, abbassare la testina di stampa di una distanza fissa nel supporto idrogel nel contenitore del campione scelto. Avviare il processo di stampa facendo clic su Stampa.
  4. Una volta completata la stampa, chiudere i contenitori dei campioni. Pulisci la stampante con etanolo al 70%. Smaltire correttamente la siringa e l'ago.

9. Coltivazione e imaging del V. cholerae

  1. Per l'imaging con un ampio campo visivo, utilizzare una fotocamera con un obiettivo zoom per la crescita delle cellule dell'immagine con una lightbox. Fotografare i campioni subito dopo la stampa a temperatura ambiente e poi trasferirli in un incubatore. Mantenere i campioni a 37 °C in un incubatore fisso tra una sessione di imaging e l'altra durante l'esperimento.
  2. Acquisisci immagini per un periodo di tempo desiderato per osservare il comportamento di crescita per lunghi periodi nella matrice granulare di idrogel.

Risultati Rappresentativi

L'utilizzo di una biostampante 3D con la matrice granulare di idrogel espande le capacità delle biostampanti di stampare colonie batteriche in forme che, se stampate su un substrato piatto, si accalancherebbero a causa della bassa viscosità della sospensione batterica. La risoluzione dell'approccio qui presentato dipende dalla velocità di estrusione, dalle dimensioni dell'ago, dalla velocità della testina di stampa, dall'aria nell'ago e dalla viscosità della sospensione batterica. A causa del basso volume della sospensione batterica, le bolle d'aria possono essere introdotte inavvertitamente durante il caricamento della sospensione batterica nella siringa e nell'ago. Ciò può portare al deposito di una bolla d'aria nella struttura stampata finale (Figura 4). Un altro modo per introdurre bolle d'aria nella stampa è se non si preme lo stantuffo per formare una piccola goccia di sospensione batterica sulla punta dell'ago prima della stampa ed esiste un traferro sulla punta dell'ago. Se non si preme lo stantuffo della siringa prima della stampa, si possono stampare volumi diversi di cellule nello stesso lotto. Tuttavia, con il passare del tempo, la bolla d'aria si dissolve nel mezzo circostante, come mostrato nella Figura 4.

Per calibrare la fase di estrusione, il volume depositato dipende da come l'attuatore lineare della testina di stampa trasla lo stantuffo della siringa, il diametro interno della siringa influirà direttamente sul volume. Inoltre, le proprietà reologiche della sospensione batterica influiranno sulla facilità con cui tagliano la contrazione dell'ago per stampare senza intoppi. Pertanto, questa procedura di calibrazione deve essere ripetuta per ogni configurazione di siringa/ago/sospensione batterica. In linea di principio, la calibrazione della siringa potrebbe essere automatizzata. Tuttavia, in pratica, scrivere un codice di questo tipo che si applichi ampiamente a molti casi d'uso sarebbe impegnativo. Ad esempio, un utente che mira a calibrare l'estrusione di circa 300 μL da una siringa da 1 mL dovrebbe ricaricare la siringa molto più frequentemente rispetto a un utente che esegue la calibrazione intorno a un volume target di 30 μL. Poiché la costante di calibrazione da E-step a volume è sconosciuta quando inizia il processo di calibrazione, l'utente potrebbe non essere in grado di prevedere esattamente la frequenza con cui è effettivamente necessario ricaricare. Inoltre, per automatizzare il processo di calibrazione, è necessario specificare le posizioni esatte di ciascuna provetta da 1,5 mL prepesata. Per garantire che tutto il bioink venga depositato dall'ago nel tubo per una calibrazione accurata, è necessario stabilire un contatto preciso tra l'ago e il fondo/parete del tubo. Senza un buon contatto, piccole goccioline possono rimanere bagnate e attaccate all'ago. Pertanto, qualsiasi variazione di posizione tra i tubi potrebbe contribuire notevolmente agli errori nel processo di calibrazione. Per questi motivi, gli autori raccomandano a ciascun utente di creare un programma di calibrazione che si adatti alle proprie esigenze specifiche.

Una caratteristica chiave dell'approccio qui presentato è la capacità di visualizzare i batteri che si diffondono attraverso i loro ambienti direttamente attraverso la motilità e la crescita utilizzando l'imaging. In una versione precedente del protocollo per l'imaging, le piastre a 6 pozzetti sono state riempite con 19 mL di una matrice granulare di idrogel. Tuttavia, anche con una stampa 3D di successo di una linea orizzontale di cellule che potrebbe essere osservata su un microscopio invertito, una densa colonia crescerebbe anche sulla superficie superiore del mezzo, limitando la visualizzazione con la microscopia in campo chiaro (Figura 5). La colonia sulla superficie superiore è probabilmente il risultato di una contaminazione dovuta al fatto che l'ago della siringa è stato inserito o rimosso dal supporto durante la stampa. Per aggirare questo problema, le linee verticali delle cellule vengono stampate in fiale a scintillazione (Figura 6A). Tuttavia, la curvatura delle fiale cilindriche ha causato distorsioni durante l'imaging. Ciò ha portato alla selezione di cuvette a parete piatta e palloni per colture tissutali come contenitori per la stampa, consentendo un imaging senza distorsioni (Figura 6B-D). Un limite dei palloni per colture tissutali è il piccolo collo inclinato che limita le geometrie che possono essere stampate.

Nel complesso, questo protocollo consente di osservare la motilità e la crescita batterica in ambienti porosi complessi su lunghe scale temporali. Alcuni esempi sono mostrati nella Figura 6B-G per V. cholerae che forma biofilm utilizzando la microscopia in campo chiaro e le cellule planctoniche di E. coli utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza a scansione laser, dimostrando la versatilità di questo approccio. In effetti, un potenziale problema delle matrici di idrogel è la loro possibile autofluorescenza quando vengono visualizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza; tuttavia, le immagini mostrate in Figura 6F,G dimostrano che tale autofluorescenza è minima nella piattaforma sperimentale qui presentata. Un'altra limitazione di tali approcci di microscopia ottica è la loro risoluzione spaziale, che è fissata dal limite di diffrazione a ~100 s nanometri; tuttavia, questa scala di lunghezza è molto più piccola delle dimensioni di una singola cellula batterica e, pertanto, le tecniche ottiche forniscono la capacità di visualizzare le cellule batteriche dalla scala delle singole cellule (Figura 6G) alla scala di colonie multicellulari più grandi 30,31,32,33. Di seguito sono descritti altri esempi.

Come notato in precedenza, l'approccio qui presentato può essere utilizzato per stampare in 3D e visualizzare colonie batteriche in piccoli (1 mL) e grandi (20 mL) volumi di matrice. Quindi, le differenze nei risultati ottenuti utilizzando volumi diversi sono descritte di seguito, utilizzando colonie stampate in 3D di V. cholerae mobili e non mobili come esempi rappresentativi. La risoluzione spaziale (larghezza della linea) della stampa è impostata dal diametro interno dell'ugello. Negli esempi descritti di seguito, un ago con un diametro interno di 0,6 mm produce una colonia cilindrica iniziale di 0,6 mm. Lavori precedenti hanno dimostrato che la risoluzione di stampa può essere ulteriormente ridotta utilizzando un capillare di vetro tirato con un diametro interno di ~100-200 μm33.

Per i piccoli volumi, vengono utilizzate due diverse matrici di idrogel granulare con due diverse distribuzioni delle dimensioni dei pori: una con una dimensione media dei pori maggiore del diametro medio di una cellula di V. cholerae, 0,2-0,4 μm36, e l'altra con una dimensione media dei pori inferiore a questo diametro. I campioni nell'arco di dodici giorni vengono sottoposti a imaging e misurati attraverso l'analisi dell'espansione areale delle colonie nel tempo (Figura 7 e Figura 8). Per le cellule non mobili, che possono diffondersi attraverso l'ambiente circostante solo attraverso la crescita cellulare, il tasso di espansione areale era simile tra le diverse matrici studiate (Figura 7), indicando che le differenze nella dimensione dei pori della matrice non influenzano la diffusione cellulare attraverso la crescita, come previsto. Al contrario, per le cellule mobili che si diffondono attraverso l'ambiente circostante attraverso la motilità attiva, il tasso di espansione areale di V. cholerae era più alto per la matrice di idrogel con i pori più grandi, per i quali il confinamento da parte dei grani di idrogel impedisce meno la motilità cellulare. Queste differenze nella diffusione batterica erano evidenti anche nelle morfologie delle colonie (Figura 8). La colonia di V. cholerae in matrici di idrogel con pori più grandi si diffonde attraverso pennacchi lisci e diffusi (Figura 8A), riflettendo la diffusione attraverso la motilità attiva come osservato in precedenza32. Infatti, coerentemente con questa interpretazione, questi pennacchi diffusi non si osservano nel caso di cellule non mobili (Figura 8C). Inoltre, i pori sono sufficientemente grandi da impedire alle cellule di spingere le perline mentre nuotano attraverso i pori. Inoltre, lo stress viscoso applicato dal nuoto è inferiore a 1 Pa, che è insufficiente per deformare sensibilmente la matrice di idrogel circostante. Al contrario, la colonia in matrici di idrogel con pori più piccoli si diffonde solo attraverso pennacchi ruvidi, simili a frattali, sia per le cellule mobili che per quelle non mobili (Figura 8B,D), riflettendo la diffusione esclusivamente attraverso la crescita cellulare, mentre le cellule crescono si deformano transitoriamente e cedono la matrice circostante. Infatti, dato che lo stress di snervamento delle matrici di idrogel è molto più piccolo della pressione di turgore delle cellule, in questo limite di piccola dimensione dei pori, la matrice fornisce solo una debole resistenza alla crescita cellulare e non sembra influenzare fortemente la struttura stampata in 3D, anche come verificato nel nostro precedente lavoro37.

Risultati simili si osservano per esperimenti eseguiti su campioni di grandi volumi; Tuttavia, data la maggiore abbondanza di nutrienti in questi campioni, gli esperimenti potrebbero sostenere la crescita cellulare su scale temporali più lunghe. Ad esempio, vengono mostrati i risultati ottenuti utilizzando le matrici granulari di idrogel in cui la dimensione media dei pori era inferiore alla dimensione delle cellule e, quindi, la diffusione cellulare era dovuta principalmente alla crescita. I campioni sono stati sottoposti a imaging per ~30 giorni nelle matrici di idrogel granulare e hanno osservato un'espansione areale simile sia per le cellule non mobili che per quelle mobili per le prime 150 ore; tuttavia, in tempi ancora più lunghi, si osserva una forte variabilità tra i campioni, con alcuni campioni che mostrano tassi di diffusione più rapidi (Figura 9 e Figura 10). È interessante notare che, dopo aver ricampionato la matrice di idrogel dopo l'esperimento - un vantaggio del grande volume della matrice di idrogel - viene misurata una diminuzione dello stress di snervamento, dei moduli di immagazzinamento e dei moduli di perdita (Figura 11), indicando che le matrici sono diventate più morbide. Questo cambiamento potrebbe essere dovuto al fatto che V . cholerae produce una molecola che sta cambiando le proprietà della matrice dell'idrogel e promuovendo la diffusione cellulare a lungo termine, che sarà interessante testare in ricerche future. Esempi delle morfologie ruvide delle colonie frattali che risultano in questi esperimenti sono mostrati nella Figura 10.

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Figura 1: Immagini della biostampante 3D personalizzata. (A) Biostampante con una testa di estrusione della pompa a siringa modificata con una siringa e un ago Luer lock monouso. Bioprinter è largo ~46 cm. (B) Immagine della stampa 3D di cellule in palloni riempiti con matrice di idrogel inceppata. La larghezza dell'immagine è di 87 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Caratterizzazione delle proprietà reologiche delle matrici granulari di idrogel. (A) Sforzo di taglio in funzione della velocità di taglio applicata. (B) Moduli di immagazzinamento e perdita, rispettivamente G' e G'', in funzione della frequenza di oscillazione. La legenda indica la frazione di massa dell'idrogel utilizzata per preparare ogni matrice di idrogel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Misurazioni della dimensione dei pori di due matrici di idrogel granulare rappresentative. Tracciando i traccianti, viene determinata la distribuzione delle dimensioni dei pori caratteristici per ciascuna matrice di idrogel. I dati sono rappresentati da 1-CDF, dove CDF è la funzione di distribuzione cumulativa. La legenda indica la frazione di massa dell'idrogel utilizzata per preparare ogni matrice. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Esempi di bolle formate durante la stampa 3D di batteri. (A) Schema della configurazione di imaging. (B) Istantanee della crescita di V. cholerae con una bolla nella parte inferiore della stampa (riquadro rosso) in matrice idrogel all'1,2% gonfia in LB. Dopo 59 ore di crescita a 37 °C, la bolla d'aria è completamente disciolta e la colonia collassa a causa dell'elasticità della matrice di idrogel. Barra della scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Immagini della linea orizzontale di V. cholerae mobile stampate in una piastra a sei pozzetti riempita con matrice di idrogel all'1,2% gonfiata in LB e del biofilm che si è formato sulla superficie superiore dopo 48 ore di incubazione a 37 °C. (A) Schema della configurazione dell'imaging. (B) La formazione di biofilm sulla superficie superiore a causa della contaminazione durante la stampa 3D riduce l'opacità e non consente un'immagine chiara della linea orizzontale. La superficie superiore forma delle rughe, presumibilmente a causa della crescita differenziale. Barra della scala = 5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Esempi di diversi contenitori di campioni che possono essere utilizzati in questo metodo. (A) V. cholerae stampato in un flaconcino di vetro riempito con matrice di idrogel granulare all'1,2% dopo 470 ore. La curvatura del flaconcino rende difficile l'imaging della crescita. Barre di scala = 5 mm. (B) V. cholerae stampato in una micro-cuvetta riempita con matrice di idrogel granulare all'1,2%. I lati piatti consentono un'immagine chiara, tuttavia, i piccoli volumi limitano la durata degli esperimenti prima che le cellule esauriscano i substrati di crescita. (C) Configurazione di imaging con un obiettivo zoom per l'immagine di V. cholerae stampata in un matraccio per coltura tissutale riempito con matrice di idrogel granulare all'1,2%. Simile alla custodia della micro-cuvetta, i lati piatti consentono un'immagine chiara. I palloni per coltura tissutale possono essere riempiti con volumi maggiori di matrice granulare di idrogel, allungando così l'arco di tempo sperimentale. (D) Immagine dall'obiettivo zoom del V. cholerae stampata all'interno di una matrice di idrogel granulare all'1,2% dopo 100 ore di incubazione a 37 °C. Barra della scala = 1 mm. (E) Impostazione dell'imaging con un microscopio confocale per l'imaging di cellule fluorescenti. (F) Proiezione 3D di micrografie confocali di E. coli fluorescenti all'interno della matrice di idrogel granulare all'1,2% dopo 10 giorni di incubazione a 37 °C. Barra della scala = 50 μm. (G) Micrografia confocale a risoluzione singola di E. coli fluorescente all'interno della matrice idrogel. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Espansione dell'area in funzione del tempo di colonie di V. cholerae stampate in 1 mL di matrici granulari di supporto idrogel. I dati sul grafico provengono dall'analisi delle immagini della Figura 8. È stato osservato che le cellule mobili (cerchio rosso chiuso e quadrato) si diffondono a un ritmo più veloce rispetto alle cellule non mobili, riflettendo la diffusione sia per crescita che per motilità. Inoltre, le cellule mobili nella matrice di idrogel con una grande dimensione dei pori (quadrati rossi) si diffondono a una velocità più veloce rispetto alle cellule nella matrice di idrogel con pori di 0,3 μm (cerchi rossi). Le cellule non mobili non mostrano alcuna differenza nel tasso di espansione areale tra le due dimensioni dei pori, poiché stanno solo crescendo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Colonie di V. cholerae stampate in 1 mL di matrici di supporto in idrogel granulare. (A) Istantanee della crescita e della motilità di V. cholerae mobile in una matrice di idrogel granulare allo 0,9% in cui la dimensione dei pori è maggiore del diametro medio della cellula. Le frecce indicano un pennacchio diffuso che si forma a causa delle cellule che si muovono attraverso la matrice di idrogel. (B) Istantanee della crescita e della motilità di V. cholerae mobile in una matrice di idrogel granulare all'1,2% in cui la dimensione dei pori è inferiore al diametro medio della cellula. Le frecce indicano un pennacchio ruvido, simile a un frattale, che si forma a causa della crescita cellulare. (C) Istantanee dell'evoluzione temporale di V. cholerae non mobile in una matrice di idrogel granulare allo 0,9% in cui la dimensione dei pori è maggiore del diametro medio della cellula. In questo caso, i pennacchi diffusi che riflettono la motilità non sono osservabili. (D) Istantanee della crescita di V. cholerae non mobile in una matrice di supporto idrogel granulare all'1,2% in cui la dimensione dei pori è inferiore al diametro medio della cellula. In questo caso, sono di nuovo osservabili pennacchi ruvidi, simili a frattali, che riflettono la crescita. Barre di scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Espansione dell'area in funzione del tempo di colonie di V. cholerae stampate in 20 mL di matrici di supporto idrogel granulare all'1,2%. Si osserva che le cellule non mobili (cerchi aperti) e le cellule mobili (cerchi chiusi) si diffondono a velocità simili per le prime 100 ore. Dopo 100 ore, si osservano differenze nei tassi di espansione areale, potenzialmente dovute all'evoluzione della variabilità in tempi lunghi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Colonie di V. cholerae stampate in 22 mL di matrici di idrogel granulare all'1,2% cresciute a 37 °C. (In alto) Istantanee della crescita di V. cholerae mobile. (In basso) Istantanee della crescita di V. cholerae non mobile. In entrambi i casi, sono osservabili pennacchi ruvidi, simili a frattali, che riflettono la crescita. Barre della scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 11: Caratterizzazione delle proprietà reologiche della matrice di idrogel granulare all'1,2% prima (0 h) e dopo l'esperimento (397 h). (A) Sforzo di taglio in funzione della velocità di taglio applicata. (B) Moduli di immagazzinamento e perdita, rispettivamente G' e G'', in funzione della frequenza di oscillazione applicata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Comandi GcodeAttività
Visualizzazione del materiale M82Modalità di estrusione assoluta
M302 S0Abilita l'estrusione a freddo
M92 E14575Impostare i passi di estrusione per mm
G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0Impostare l'asse z e la posizione di estrusione su zero e la posizione x-, y su 35,71 mm e y 88 mm dove si trova la testina di stampa quando inizia il codice g
M221 S100 T0imposta la portata al 100%
Visualizzazione del materiale M107Spegni la ventola
G1 F1 X35.61 Y81 E0.1Estrudere i 20 μL di bioink nella matrice a una velocità di avanzamento di 50 μL/min dove è stata impostata la posizione corrente
G0 F200 Z60Estrarre l'ago dalla matrice e dal contenitore del campione a una velocità di 200 mm/min
G0 F500 X65.81 Y81.0Spostare l'ago sul successivo contenitore del campione a una velocità di 500 mm/min
G0 F100 Z0Abbassare l'ago nel contiainer del campione successivo nella stessa posizione z in cui è iniziata la stampa a una velocità di 100 mm/min
G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2Estrudere i 20 μL di bioink nella matrice a una velocità di avanzamento di 50 μL/min dove è stata impostata la posizione corrente
G0 F200 Z60Estrarre l'ago dalla matrice e dal contenitore del campione a una velocità di 200 mm/min
G0 F500 X96.01 Y81.0Spostare l'ago sul successivo contenitore del campione a una velocità di 500 mm/min
G0 F100 Z0Abbassare l'ago nel contenitore del campione nella stessa posizione z in cui è iniziata la stampa a una velocità di 100 mm/min
G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3Estrudere i 20 μL di bioink nella matrice a una velocità di avanzamento di 50 μL/min dove è stata impostata la posizione corrente
G0 F200 Z60Estrarre l'ago dalla matrice e dal contenitore del campione a una velocità di 200 mm/min
G0 F500 X126.21 Y81.0Spostare l'ago sul successivo contenitore del campione a una velocità di 500 mm/min
G0 F100 Z0Abbassare l'ago nel contiainer del campione successivo nella stessa posizione z in cui è iniziata la stampa a una velocità di 100 mm/min
G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4Estrudere i 20 μL di bioink nella matrice a una velocità di avanzamento di 50 μL/min dove è stata impostata la posizione corrente
G0 F200 Z80Estrarre l'ago dalla matrice e dal contenitore del campione a una velocità di 200 mm/min

Tabella 1: Programmazione G-code per la stampa di linee verticali della sospensione batterica.

File supplementare 1: File STL per il morsetto inferiore Siringhe Luer lock monouso da 1 mL per l'estrusore di siringhe. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 2: File STL per il morsetto superiore per siringhe Luer lock monouso da 1 mL per l'estrusore di siringhe. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 3: File STL per l'adattatore per siringa per siringhe Luer lock monouso da 1 mL per l'estrusore di siringhe. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 4: file STL per il portacampioni in cuvetta. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 5: file STL per il portacampioni di flaconi di tessuto. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 6: file STL per la piastra a 6 pozzetti e il letto di stampa della piastra di Petri da 35 mm. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 7: Script personalizzato per il tracciamento delle particelle. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

Passaggi critici del protocollo
È importante assicurarsi che durante la preparazione di ogni matrice di idrogel, la matrice sia realizzata in un ambiente sterile. In caso contrario, può verificarsi una contaminazione, che si manifesta, ad esempio, come microcolonie (piccoli sferoidi) nella matrice dopo diversi giorni. Durante il processo di miscelazione, è importante che tutte le particelle di idrogel granulare secco vengano disciolte. Inoltre, quando si regola il pH di ciascuna matrice di idrogel con il NaOH, i granuli inizieranno a gonfiarsi, il che aumenta la viscosità della matrice di idrogel, rendendo più difficile la miscelazione. L'uso del robot da cucina contribuirà a garantire che l'NaOH sia ben miscelato nella matrice di idrogel. Durante il caricamento di ogni sospensione batterica, possono formarsi sacche d'aria nell'ago. Per evitare questo problema, assicurarsi che la punta dell'ago si trovi sempre nella sospensione batterica nella provetta da centrifuga e non sul fondo della provetta o vicino alla superficie superiore. Un altro modo per superare questo problema è quello di far crescere grandi volumi di cellule e quindi avere volumi maggiori di sospensione batterica per la stampa.

Limitazioni
Attualmente, durante la stampa, la bassa viscosità della sospensione batterica limita le geometrie che possono essere stampate e spesso porta alla formazione di un biofilm e alla crescita sulla parte superiore della superficie della matrice di idrogel a causa delle cellule in tracce. Esistono alcuni potenziali metodi per superare questa limitazione, tra cui l'aumento della viscosità della sospensione batterica o l'ulteriore ottimizzazione delle impostazioni della stampante 3D. Per aumentare la viscosità della sospensione batterica, si potrebbe mescolare la sospensione batterica con un altro polimero, ad esempio l'alginato, che è stato utilizzato in precedenza per la stampa 3D di batteri su superfici piane38. Le impostazioni della stampante possono essere ulteriormente ottimizzate per consentire la retrazione dello stantuffo della siringa durante il ritiro dell'ago dalla matrice di idrogel granulare, il che avrebbe il potenziale di impedire il deposito di cellule durante la rimozione dell'ago dalla matrice di idrogel.

L'importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi
Il metodo qui descritto consente la stampa di colonie batteriche in matrici granulari di idrogel. Le matrici granulari di idrogel consentono di studiare l'impatto di fattori ambientali esterni (ad esempio, dimensione dei pori, deformabilità della matrice) sulla motilità e sulla crescita dei batteri. Inoltre, mentre in questo lavoro, LB viene utilizzato come mezzo di crescita liquido per gonfiare la matrice di idrogel, la matrice di idrogel può essere gonfiata con altri mezzi di crescita liquidi, compresi i terreni con antibiotici. I metodi precedenti per lo studio dei batteri in ambienti confinati erano limitati dalla lunghezza del tempo sperimentale, dalla dimensione della maglia del polimero e dalla rigidità della matrice di idrogel circostante37,38. Esistono già protocolli per la creazione di matrici granulari di idrogel da diversi polimeri, quindi il potenziale per studiare gli impatti di diverse condizioni ambientali sulla motilità e sulla crescita dei batteri è enorme. Questo metodo consente lo studio dei batteri in ambienti di controllo che ricapitolano più facilmente gli ambienti che i batteri abitano nel mondo reale, come il muco ospite o il suolo. Un'altra limitazione di molti altri metodi è l'opacità della matrice circostante; tuttavia, questo approccio che utilizza materiali otticamente trasparenti offre la possibilità di esplorare, ad esempio, il controllo optogenetico e il patterning dei batteri in 3D.

Oltre a studiare la motilità e la crescita, il metodo di stampa 3D qui descritto supera i limiti di molti altri metodi di bioprinting che richiedono la deposizione di un bioink su un substrato e sono, quindi, limitati nell'altezza del materiale vivente ingegnerizzato che possono produrre. In futuro, questo protocollo di bioprinting potrà essere ulteriormente ampliato per fabbricare materiali bioibridi mescolando polimeri con cellule che formano biofilm. Le matrici di idrogel granulare forniscono supporto per la stampa 3D di materiali viventi ingegnerizzati più spessi e su larga scala e geometrie più complesse rispetto a molti altri metodi di bioprinting batterico attuali. Mentre questo lavoro ha utilizzato solo V. cholerae ed E. coli, anche altre specie, come Pseudomonas aeruginosa, sono state stampate con successoin 3D. Oltre alla stampa, la stampante può essere adattata per eseguire un campionamento controllato dei batteri dopo la crescita per vedere se ci sono stati cambiamenti genetici, ad esempio.

Divulgazioni

La piattaforma sperimentale utilizzata per stampare in 3D e visualizzare le comunità batteriche in questa pubblicazione è oggetto di una domanda di brevetto depositata dall'Università di Princeton per conto di Tapomoy Bhattacharjee e S.S.D. (PCT Application number PCT/US/2020/030213).

Riconoscimenti

R.K.B. riconosce il sostegno del Presidential Postdoctoral Research Fellows Program. Questo materiale si basa anche sul lavoro supportato dalla sovvenzione del programma di borse di studio per la ricerca universitaria NSF DGE-2039656 (ad AMH). A.S.D.-M. e H.N.L. riconoscono il supporto del Lidow Independent Work/Senior Thesis Fund presso l'Università di Princeton. Ringraziamo anche il laboratorio di Bonnie Bassler per aver fornito ceppi di V. cholerae. S.S.D. riconosce il supporto delle sovvenzioni NSF CBET-1941716, DMR-2011750 e EF-2124863, nonché dell'Eric and Wendy Schmidt Transformative Technology Fund, della New Jersey Health Foundation, del Pew Biomedical Scholars Program e del Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL cuvettesVWR97000-586
1 mL Luer lock syringeBH SuppliesBH1LL
10 M NaOHSigma-Aldrich72068
100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres)  Invitrogen, (ThermoFischer Scientific)
F8803
15 mL centrifuge tubesThermoFischer Scientific14-955-237
20 G blunt needleMcMaster Carr75165A252
25 mL tissue culture flasksVWR10861-566
3D printerLulzbotLulzBot Mini 2
3D printing softwareCuraCura-Lulzbot
50 mL centrifuge tubesThermoFischer Scientific14-955-239
AgarSigma-AldrichA1296
Carbomer Granular Hydrogel ParticlesLubrizol Carbopol 980NFdry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers
Centrifuge (2 mL tube capacity)VWR2405-37
Centrifuge (50 mL tube capacity)ThermoFischer Scientific75007200Sorvall (brand) ST 8 (model)
Confocal MicroscopeNikonA1R+ inverted laserscanning
confocal microscope
Glass bottom petri dishCellvisD35-10-1-N
Lennox LB (Lubria Broth)Sigma-AldrichL3022
M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket CapMcMaster Carr91290A478
M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex NutMcMaster Carr93187A300
Open-source syringe pumpCustom-madeReplistruder 4https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468067220300791
Petri dish (60 mm round)ThermoFischer ScientificFB0875713A
Shear RheometerAnton PaarMCR 501
Ultrasonic cleanerVWR97043-992

Riferimenti

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