Supportato da un finanziamento della University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule delle isole Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.

1. Programma di setup <ol><li> Isolamento isole umane è una procedura momento delicato che coinvolge il lavoro di squadra e, quindi, quattro individui sono necessarie per condurre questa procedura. Il team è guidato dal chirurgo, che analizza e cannulates il pancreas. </li><li> L&#39;isolamento delle isole inizia il minuto la squadra entra nel UIC di isolamento delle isole. I membri del team in modo che tutta la strumentazione necessaria, come la centrifuga, viene controllata e acceso. Inoltre assicuratevi di disinfettare tutte le cappe e superfici. </li><li> Due persone si impostare la tabella incannulazione, granitore, circuito digestione, unità di perfusione, macchina purificazione COBE, e tavoli operatori. </li><li> Contemporaneamente, due altri membri del team si preparano i mezzi di comunicazione che è necessario durante l&#39;isolamento. </li><li> Avanti, tubi batteriologia (bottiglie, tubi, la forma e la borsa), tubi di campionamento (pre-riempite con lavaggio), e tubi di valutazione e piatti sono preparati. </li><li> Preparate il tubo di purificazione impostata come segue: Il 1 ° tubo vuoto e segnato a 150 ml, tubi 2-12 riempito con 200 ml di M199 mezzi di comunicazione integrata con albumina umana (soluzione di lavaggio) e segnato a 230 ml, e infine un tubo da 50 ml riempito con 50 ml di soluzione di lavaggio. Una volta che questi passaggi di preparazione sono completi siamo pronti per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas. </li></ol> 2. Pancreas preparazione e perfusione <ol><li> Per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas, un operatore rimuove l&#39;organo dalla confezione utilizzando una tecnica sterile. Il chirurgo trasferirà il pancreas al tavolo di decontaminazione. </li><li> Il chirurgo riempire una siringa da 60 ml con la soluzione originale preservazione del pancreas e consegnarla ad un operatore, che lo utilizzano per riempire preparato &quot;Procurement&quot; bottiglie di batteriologia. </li><li> Dopo un controllo visivo per stabilire se l&#39;organo è adatto per l&#39;isolamento delle isole (Se il pancreas viene danneggiato durante il prelievo o anatomicamente anomali, che non possono essere utilizzati per l&#39;isolamento delle isole), il chirurgo dovrà chiedere a un operatore per preparare collagenasi. Ricorda che tale ri-sospensione del tempo varia tra i marchi di enzimi diversi e molto. </li><li> Quando il chirurgo è pronto, portare le soluzioni di decontaminazione (Betadine, Fungizone / Cefazolina e HBSS) alla tabella di decontaminazione e versarli in appositi contenitori. Chirurgo esegue decontaminazione pancreas lavaggio per un minuto il pancreas in ciascuna delle soluzioni di decontaminazione. Il pancreas viene quindi posto in un vasetto sterile in cui sarà pesato. Dopo che il peso è entrato nel batch record, il pancreas viene posizionato in padella con un po cannulazione soluzione di conservazione. </li><li> Il chirurgo esporre e parzialmente incidere il condotto principale e cannulate ogni metà del pancreas con una cannula. La cannula viene garantito da sutura. Per profumato il pancreas, prima spostare l&#39;unità perfusione e versare la soluzione enzimatica nel bacino. Perfusione tempo totale è di circa 10 minuti, a 80 mmHg per 5 minuti, poi a 180 mmHg per 5 minuti. Pancreas disteso dopo la perfusione. </li><li> Spostare il pancreas perfuso alla padella incannulazione, dove viene tagliato il tessuto adiposo dal pancreas con attenzione. Poi tagliare il pancreas in 10-12 pezzi e trasferimento a Ricordi Camera per la digestione. </li></ol> 3. Pancreas digestione <ol><li> Per iniziare la fase di digestione, il pancreas trasferimento alla Camera vuota Ricordi, aggiungere una fiala 2,5 ml di Pulmozyme, mettere sullo schermo (evitare grossa fetta del blocco tessuto della camera), chiudere la camera, e riempire il sistema. </li><li> Iniziare a pompare la soluzione per 5 minuti. Agitare delicatamente la camera a disperdersi uniformemente soluzione calda per tutto. Dopo cinque minuti, agitare delicatamente la camera per la fase di digestione intero. Mantenere la temperatura a 37 ˚ C. </li><li> Rock the camera delicatamente fino a quando la temperatura raggiunge i 37 °, poi scuotere la camera. Prelevare un campione ogni due minuti e rilevare se isolotti liberi si trovano nel campo d&#39;applicazione. Registrare le informazioni isolotto di valutazione nella tabella digestione dei batch record. Continuerà a monitorare la percentuale di isolotti finché non ci sono il 50% di loro flottante libero e isolato nella soluzione. </li></ol> 4. Raccolta dei tessuti <ol><li> Una volta che il 50% delle isole si trovano liberi nei campioni, la digestione viene interrotta con l&#39;aggiunta di freddo soluzione di diluizione RPMI nel circuito. Tessuto viene raccolto in 500 ml provette coniche pre-riempite con 30 ml di albumina umana. Una volta che i tubi sono filata, aspirazione fuori dal surnatante e lavare il pellet con la soluzione di lavaggio a freddo. Gira i tubi conici a 1100 RPM (rotazioni al minuto) per 1 minuto, 4 ˚ C. </li><li> Combina tutti i tubi di raccolta sospesa con tessuto pancreatico digeriti in un singolo da 500 ml. Quando un tubo è pieno di tessuto lavato, girare e ripetere il processo di lavaggio fino a tutto il tessuto è stato lavato più volte. Spin questo tubo e trasferire il tessuto in un unico tubetto da 250 ml. Portare il volume fino a 250 ml conM199 soluzione di lavaggio integrato con HA e prepararsi per il campionamento. </li><li> Prendete un campione di 1 ml con una pipetta e aggiungere in una provetta da 15 ml conica pre-riempita con 9 ml di soluzione di lavaggio. Quindi mescolare delicatamente invertendo il tubo da 15 ml e da questa, campione fuori 1ml direttamente in un piatto della griglia di conteggio. Contare le celle, e calcolare il numero di cellulare utilizzando un fattore di diluizione del 2500 (10x250). </li><li> Spin il tubetto da 250 ml conica e aggiungere 150 ml di UW (Università del Wisconsin), soluzione che di solito uso per la conservazione degli organi. Quando UW si aggiunge, mescolare la sospensione cellulare accuratamente con la pipetta. Registrare e comunicare all&#39;operatore purificazione l&#39;ora di inizio di UW. Lasciare il tubo (s) su ghiaccio e agitare di tanto in tanto. Ora le isole possono essere ulteriormente purificato. </li></ol>

<ol>
	<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+for+allotransplantation:+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function.">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li><li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient.">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li><li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance.">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li><li>Fridell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation.">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li><li>Potdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation.">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li><li>Salehi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution.">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+islet+isolation+from+human+pancreas.">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38, 140-142 (1989).</li><li>Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+and+isolation+variables+predicting+human+islet+isolation+success.">Donor and isolation variables predicting human islet isolation success.</a> Transplantation. 85, 950-955 (2008).</li><li>Toso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+human+islet+of+Langerhans+isolation+yields.">Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields.</a> Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).</li></ol>

Ci sono una varietà di fattori che influenzano il risultato dell&#39;isolamento 9,10. Tra questi, la digestione del tessuto pancreatico gioca un ruolo di primo piano. Sulla base della nostra esperienza umana isolamento delle isole, abbiamo riassunto i seguenti punti critici, che potrebbe potenzialmente influenzare il rendimento delle isole e la qualità. <ol><li> Il tempo di digestione è diversa quando i diversi tipi di enzimi sono utilizzati. </li><li> Non appena il 40-50% delle isole completamente separate dal t...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ice Slush Machine</td>
<td>equipment</td>
<td>Taylor Company</td>
<td>K4036546</td>
<td>make sterile ice</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>424803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1</td>
<td>equipment</td>
<td>Leica Diagnostic Instrument Co</td>
<td>4103</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Culture Dish with 2 mm Grid</td>
<td>equipment</td>
<td>Nunc Brand Products</td>
<td>174926</td>
<td>islet counting</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital Water Bath EX7</td>
<td>equipment</td>
<td>NesLab</td>
<td>105361058</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>equipment</td>
<td>IBI:IR</td>
<td>60444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MonoBloc Balance AB 104-S</td>
<td>equipment</td>
<td>Metler Toledo</td>
<td>1119430864</td>
<td>measure pancreas weight</td>
</tr>
<tr>
<td>MasterFlex II Speed Controller</td>
<td>equipment</td>
<td>Cole Parmer Instrument Co</td>
<td>J00006445</td>
<td>adjust flow speed during degestion</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital Sight DS L1</td>
<td>equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>217267</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion Unit</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom Made/Swiss</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cooler for perfusion unit</td>
<td>equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>3013P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ricordi Chamber</td>
<td>equipment</td>
<td>University of Miami</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI dilution solution</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99783024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>University of Wisconcin (UW) solution</td>
<td>reagent</td>
<td>DURAMED</td>
<td>1000-46-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-597-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>25% Human Albumin</td>
<td>reagent</td>
<td>GRIFOLS</td>
<td>NDC 61953-0002-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 media (wash solution)</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-784-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase NB1 GMP grade</td>
<td>reagent</td>
<td>SERVA Electrophoresis</td>
<td>N0002937</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease NB1 GMP grade</td>
<td>reagent</td>
<td>SERVA Electrophoresis</td>
<td>N0002936</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Betadine</td>
<td>reagent</td>
<td>Cardinal Health</td>
<td>29906-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cefazolin</td>
<td>reagent</td>
<td>West-Ward Pharmaceutical</td>
<td>NDC 0143-9924-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithizone</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma </td>
<td>D5130</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human pancreatic islet isolation: part i: digestion and collection of pancreatic tissue

Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l&#39;individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all&#39;anno. Nonostante l&#39;uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici<sup&gt; 1</sup&gt;, Senza il rischio di gravi episodi di ipoglicemia che sono associati con la terapia insulinica intensiva. Fornire sufficiente massa isolotto è importante per il trapianto di isole pancreatiche di successo. Tuttavia, caratteristica dei donatori, reperimento di organi e la conservazione influenzare l&#39;esito isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Presso l&#39;Università dell&#39;Illinois a Chicago (UIC), abbiamo sviluppato un protocollo di successo isolamento con pendenza purificazione migliorato<sup&gt; 3</sup&gt;. Il programma è iniziato nel gennaio 2004, e più di 300 isolamenti sono stati effettuati fino a novembre 2008. Il pancreas sono stati inviati nelle soluzioni di conservazione a freddo (UW, University of Wisconsin o HTK, Istidina, Triptofano chetoglutarato)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Al Laboratorio cella d&#39;isolamento a UIC per l&#39;isolamento delle isole. Isole pancreatiche sono stati isolati con il metodo UIC, che è una versione modificata del metodo originariamente descritto da Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. In breve, dopo aver pulito il pancreas dal tessuto circostante, è stato perfuso con soluzione enzimatica (Serva Collagenasi + Neutro Sigma enzima proteasi o V). Il pancreas è stato dilatato poi trasferito nella camera di digestione Ricordi, collegato ad una modifica, sistema chiuso tubi circolazione, e riscaldato a 37 ° C. Durante la digestione, la camera era scosso dolcemente. I campioni sono stati presi costantemente per monitorare il processo di digestione. Una volta libero isolette sono state rilevate al microscopio, la digestione è stato fermato da lavaggio a freddo (4 ° C) RPMI soluzione di diluizione (Mediatech, Herndon, VA) nel sistema di circolazione per diluire l&#39;enzima. Dopo essere raccolte e lavate in M199 mezzi di comunicazione integrato con albumina umana, il tessuto è stato campionato per la pre-purificazione contare e incubati con soluzione UW prima purificazione. Processo di purificazione saranno descritti nella Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane.

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Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l&#39;isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.2K Views.  University of Illinois, Chicago. Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.