Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere ai problemi chiave nei campi della virologia e della microbiologia relativi all'enumerazione di batteriofagi da campioni complessi e diagnostica e terapie basate su batteriofagi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una quantificazione efficiente in termini di tempo e accurata di un gran numero di campioni provenienti da esperimenti di biopanning di visualizzazione del fago non fattibili con saggi tradizionali. A dimostrare la procedura saranno Rashmi Mohanty e Jasmim Leal, studenti laureati del mio laboratorio.
Dopo aver progettato i primer e aver creato una concentrazione di stock, ottenere il DNA del fago T7 di riferimento ad una concentrazione di 0,1 microgrammi per microlitro. Utilizzando acqua ultrapura, diluire serialmente questo DNA dieci volte, da un milione di femtogrammi per microlitro a un femtogramma per microlitro in tubi PCR da 0,2 millilitri. Preparare 20 microlitri di ogni concentrazione, assicurandosi di cambiare le punte delle pipette e vortice i tubi tra ogni fase della diluizione.
Quindi convertire la concentrazione di DNA di riferimento del fago T7 da femtogrammi per microlitro in copie del genoma per microlitro. In primo luogo, pipetta 200 microlitri del campione T7 phage clone in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri per ciascuno dei 10 campioni desiderati. Aggiungere due microlitri di DNasi uno a ciascun tubo.
Limitare i tubi e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti in un bagno secco riscaldato. Quindi incubare a 100 gradi Celsius per 15 minuti in un bagno secco riscaldato. Centrifugare i tubi contenenti i fagi trattati termicamente a 18,534 volte g per 10 secondi.
Posizionare i tubi centrifugati su un mixer a vortice impostato in modalità di attivazione touch per 10 secondi per mescolare i fagi. Gira di nuovo a 18.534 volte g per 10 secondi. Successivamente, lasciare i campioni sul banco di laboratorio circa un'ora per raffreddarli a temperatura ambiente.
Preparare la premiscura qPCR per 10 campioni di fago biopanato di concentrazione sconosciuta e sette campioni di concentrazioni standard in triplice copia. Risultando in una premiscele per 51 campioni contenenti 255 microlitri di mix master qPCR, 51 microlitri di primer e 102 microlitri di acqua. Aliquota otto microlitri della miscela PCR preparata in 51 pozzali di una piastra qPCR da 96 porri.
Aggiungere quindi due microlitri di campioni di fago T7 trattati termicamente a ciascuno di questi pozzi, erogarli sotto la superficie della premisce qPCR. Utilizzando pellicola adesiva, sigillare la piastra. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per ridurre al minimo lo sbiancamento fotografico a fluorescenza e quindi procedere a far funzionare la piastra sull'apparecchiatura qPCR.
Impostate le condizioni di ciclo e le impostazioni della curva di fusione come delineato nel protocollo di testo. Dopo l'esecuzione del qPCR, il plottaggio di amplificazione, il plottaggio della curva di fusione e il plottaggio multicomponente vengono analizzati dai dati grezzi. Il grafico di amplificazione indica se l'amplificazione PCR di ogni campione ha esito positivo o meno.
Il plot multicomponente rappresenta l'amplificazione e il decadimento del segnale fluorescente durante i cicli di amplificazione. Mentre il grafico della curva di fusione viene utilizzato per convalidare la specificità dei primer, poiché ogni prodotto PCR ha una temperatura di fusione unica. La curva standard viene quindi generata dal DNA di riferimento.
Qui l'efficienza di amplificazione è calcolata come 92,4%I dati rappresentativi di uno studio qPCR vengono quindi confrontati con lo stesso fago che sono stati quantificati da un saggio di placca a doppio strato nell'intervallo testato da 10 a 10 milioni di copie del genoma per microlitro. Come si vede qui, il numero di fagi nella quantitazione qPCR è più alto che nel saggio della placca. La ripetibilità del metodo qPCR rappresentato dal coefficiente di varianza ha valori che vanno dal 2,85 al 27,2%Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ci sono numerose considerazioni nello sviluppo e nell'uso di qPCR per quantificare accuratamente i fagi, incluso un attento trattamento e preparazione dei campioni e la calibrazione delle apparecchiature pertinenti.
Seguendo questo metodo, altre tecniche possono essere eseguite al fine di enumerare le particelle di fago in una varietà di applicazioni incluse nella biopanning in vivo, nella preparazione del DNA della libreria di fago e nel sequenziamento e nel rilevamento del fago di nuova generazione in campioni ambientali complessi. Non dimenticare che i fagi sono considerati pericoli biologici in laboratorio e precauzioni come dispositivi di protezione individuale, compresi guanti e camici da laboratorio, dovrebbero sempre essere indossati durante l'esecuzione della procedura.
