Il lavoro in questo manoscritto è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Radioterapia Oncologica e Huntsman Cancer Institute e il National Institute of Health sovvenzione (R01-CA188520) di SB. Ringrazio Danielle Johnson e Steven Bennett nel mio laboratorio per dimostrare il protocollo e spiegando i suoi benefici. Sono grato al Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) per i commenti critici sul manoscritto.

1. immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in seguito BrdU etichettatura <ol><li> Culture cellule NIH3T3 in presenza sia di DMSO o inibitori selettivi HDAC1,2 come descritto in precedenza 6. </li><li> Dopo il trattamento con inibitori selettivi DMSO o HDAC1,2, aggiungere BrdU alle celle in una cappa coltura tissutale sterile. Incubare 2 x 10 6 cellule NIH3T3 placcati in 10 ml mezzi NIH3T3 con una concentrazione finale di 20 mM di bromodeossiuridina (BrdU) per 60 min in una sterile 37 ° C coltura tissutale incubatore. </li><li> Crosslink proteine ​​intracellulari DNA aggiungendo formaldeide direttamente al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 1%. Incubare 2 x 10 6 cellule NIH3T3 con formaldeide a temperatura ambiente per 10 min su un agitatore. </li><li> Quench la reticolazione mediante l&#39;aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 125 mM. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su un agitatore. </li><li> Togliere la carta e raccogliere le cellule in PBS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin cells a 956 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare il pellet di cellule due volte con PBS freddo. Rimuovere PBS dal tubo. Conservare il pellet reticolato cellulare senza PBS (surnatante) a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare il lisato dal pellet cellulare reticolato aggiungendo tampone FA140 500 microlitri (50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% sodio desossicolato) integrato con inibitore della proteasi cocktail. </li><li> Taglio la cromatina dalle sonicazione dei campioni cinque volte al potere il 35% e con un impulso di 15 secondi, 0,9 secondi acceso e 0,1 secondi spento impostazione. Tenere le provette in ghiaccio dopo ogni turno di ultrasuoni per evitare il riscaldamento dei campioni. <ol><li> Controllare il taglio su un gel DNA come l&#39;efficienza di taglio varierà tra i diversi sonicatori. Per controllare sonicazione, invertire reticolazione con l&#39;aggiunta di NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e eseguire i passaggi 1.17.1. - 1.22. Esegui eluita 10 microlitri DNA su un gel di agarosio 1,5% per verificare se il taglio ètra 300-700 bp con una intensità media a 500 bp. </li></ol></li><li> Dopo sonicazione, centrifugare i campioni per 10 min a 17.949 xga 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta. <ol><li> Eseguire la stima delle proteine ​​utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare la stessa quantità di lisato per il chip di controllo e campioni sperimentali. In generale, utilizzare 1 mg di lisato totale per reazione chip. </li></ol></li><li> Preparare 50% sospensione di proteina A-agarosio utilizzando tampone FA140 contenente inibitori delle proteasi cocktail. Aggiungere 1/10 volume del cocktail inibitore della proteasi. Calcolare il volume di perline necessari in base al numero di campioni in totale. <ol><li> Lavare perline Proteina A-agarosio con tampone FA140 due volte per rimuovere il tampone di conservazione e aggiungere un volume uguale di tampone FA140 ai talloni per fare 50% slurry. </li><li> Per rimuovere le proteine ​​che non si legano specificamente ai talloni, aggiungere 50 ml di 50% sospensione di Proteina A-agarosio e incubate i campioni a 4 ° C con rotazione costante end-over-end in un mixer rosticceria per 30 min. </li></ol></li><li> Spin i campioni a 956 xg a 4 ° C per un minuto. Raccogliere il surnatante ed eseguire immunoprecipitazione tramite l&#39;aggiunta di 8 microlitri H4K16ac anticorpo o 5 ml (5 mg) di 1 mg / ml di anticorpo SMARCA5 il surnatante. Incubare a 4 ° CO / N con rotazione end-over-end costante in un mixer rosticceria. </li><li> Salva 1/10 ° di un estratto per il controllo &#39;input&#39; e impostarlo come parte a -20 ° C. L&#39;ingresso deve essere inverso reticolato con i campioni IP. </li><li> Utilizzare la stessa quantità di IgG di coniglio (5 ml di 1 mg / ml) come campione di controllo negativo immunoprecipitazione. </li><li> Il giorno seguente, aggiungere 50 ml di 50% proteina A-agarosio slurry all&#39;estratto e incubare per 1 ora a 4 ° C con rotazione. </li><li> Pellet agarosio per centrifugazione a 956 xg per 2 minuti a 4 ° C, rimuovere con attenzione il surnatante e wash le perline con i seguenti buffer in sequenza. Nelle preparazioni tampone, aggiungere inibitori della proteasi a destra prima dell&#39;uso. <ol><li> Lavare con sale basso Immune Complex tampone di lavaggio (FA140; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end. </li><li> Lavare con Salt Immune Complex tampone di lavaggio ad alta (FA500; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 500 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end. </li><li> Lavare con LiCl Immune Complex tampone di lavaggio (concentrazione finale di 10 mM di Tris-Cl pH 8,0, 250 mM di LiCl, 0,5% e 0,5% NP40 desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end. </li></ol></li><li> Dopo lavaggi come descritto sopra, aggiungere 200 microlitri soluzione di eluizione (concentrazione finale di 1% SDS e 100 mM sodio bicarbonato) e incubate a temperatura ambiente per 15 min con rotazione end-over-end a RT. </li><li> Spin i campioni a 956 xg a RT e trasferire l&#39;eluato in una nuova provetta da 1,5 ml. Ripetere il passaggio 1.15 con l&#39;aggiunta di soluzione di eluizione 200 l. </li><li> Per 400 ml di eluato, aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e mescolare bene. <ol><li> Inoltre, aggiungere la soluzione di eluizione 400 microlitri di 10 microlitri di ingresso che è stato allocato (passo 1.11) e aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M di invertire campioni di ingresso reticolazione pure. Invertire reticolare i campioni incubando a 65 ° C bagnomaria per 5 ore. </li></ol></li><li> Aggiungere 1 ml di 100% EtOH al eluato reverse-reticolato. Mescolare bene e incubare a -80 ° C per 2-3 ore oppure a -20 ° CO / N. Spin i campioni a 17.949 xg per 15 minuti e scartare l&#39;etanolo. </li><li> Aggiungere 800 ml 70% di etanolo per lavare il pellet. Spin a 17.949 xg per 15 min a 4 ° C e scartare etanolo. Spin brevemente per rimuovere qualsiasi residuo di etanolo. Asciugare i campioni a 37 ° C per 10 min per rimuovere l&#39;etanolo residuo. </li><li> Sciogliere in 90 microlitri DNA RNasi e DNasi acqua libera e aggiungere 2 microlitri 10 mg / ml RNasi a 0,2 mg / ml concentrazione finale. Incubare a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 5% SDS). Mescolare bene e aggiungere 1 ml proteinasi K. Incubare a 42 ° C per 1 ora. </li><li> Purificare ingresso e ChIP DNA usando commerciale kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore ed eluire il DNA in 50 microlitri acqua. Conservare DNA a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 2. Slot blot analisi del DNA ChIP <ol><li> Misurare la resa di ingresso e di DNA ChIP eluito in 50 microlitri acqua come descritto al punto 1.22 utilizzando uno spettrofotometro a 280 nm secondo il protocollo del produttore. </li><li> Prendere volumi uguali (50 microlitri) di ingresso o di DNA immunoprecipitato che si trovano all&#39;interno della gamma lineare di rilevamento. <ol><li> Ad esempio, se l&#39;ingressoResa del DNA è di 1,5 ng / ml, poi prendere 30 ml (o 45 ng di DNA totale) e fare volume di 50 ml con acqua. Per fattore ChIP, prendere l&#39;intero 50 microlitri eluato dal punto 2.1 e passare al punto 2.3. </li></ol></li><li> Denaturare 50 microlitri di ingresso o DNA immunoprecipitato aggiungendo 2,5 volumi di 0,4 N NaOH, vortex brevemente e centrifugare per 956 xg per 10 sec, e incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Neutralizzare il DNA denaturato con l&#39;aggiunta di 175 ml di 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugare per 956 g per 10 secondi e posizionare i campioni sul ghiaccio. </li><li> Preparare una diluizione seriale di ingresso e di DNA immunoprecipitato per la Slot Blot test come descritto di seguito. <ol><li> Seguire i passaggi 2,3-2,4 per ottenere un volume totale di 350 microlitri del campione (ad esempio, 50 ml di ingresso / DNA ChIP, 125 ml 0,4 N NaOH, 175 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8). Nota: Per l&#39;istanza indicato in precedenza, 45 ng di DNA ingresso finirà per essere 0,129 ng / ml. </li><li> Per il DNA di ingresso, etichettare tre tubos come 100, 50 e 25 e aggiungere 100 ml, 50 ml e 25 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Rendere il volume finale a 100 ml con acqua priva di nucleasi. Per DNA chip, label tre tubi da 200, 100 e 50 e aggiungere 200 microlitri, 100 microlitri e 50 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Fai volume finale a 200 ml con acqua priva di nucleasi. </li></ol></li><li> Tagliare la membrana alla dimensione dell&#39;apparato Slot Blot. Pre-bagnare la membrana e carta assorbente in 20x SSC prima e prima di aggiungere DNA. Assemblarle nell&#39;apparato macchia slot secondo il protocollo del produttore. </li><li> DNA pipetta dal punto 2.5.2 in apposite cave. Applicare il vuoto lentamente per tirare il DNA sulla membrana zeta-sonda. Arrestare vuoto dopo tutti i campioni sono passati attraverso l&#39;apparecchio. <ol><li> Smontare l&#39;apparato e immobilizzare immediatamente il DNA sulla membrana utilizzando un reticolante UV. Avere il lato del DNA nella reticolante UV e utilizzare il autocrosslink impostazione nel reticolante. Seguire il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Rileva BrdU sulla macchia slot eseguendo western blotting. <ol><li> Bloccare la membrana con 5% di latte secco non grasso in PBS contenente 0,1% Tween-20 (PBST) per 1 ora a RT per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alla membrana. </li><li> Aggiungere anticorpo primario anti-BrdU (diluizione 1: 500) diluito nel latte secco non grasso 1% in PBST e incubare il blot con l&#39;anticorpo primario per 3 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l&#39;incubazione anticorpo primario. </li><li> Aggiungere anticorpo secondario anti-topo HRP-coniugato alla macchia (1: 5.000 diluizione) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l&#39;incubazione anticorpo secondario. NOTA: utilizzare un volume sufficiente di anticorpi per coprire completamente la membrana durante l&#39;incubazione anticorpi primari e secondari. </li></ol></li><li> Preparare la miscela ECL e aggiungerlo alla ac macchiacondo protocollo del produttore. Incubare la membrana con mix ECL per 5 minuti a RT. <ol><li> Posizionare la membrana in una cassetta a raggi X, esporre la membrana alla pellicola a raggi X e sviluppare il blot usando il protocollo del produttore. </li><li> Quantificare il segnale ottenuto per l&#39;ingresso e il DNA chip dopo la scansione le macchie utilizzando il software Image J secondo il protocollo del produttore. Per la quantificazione, utilizzare il segnale che è all&#39;interno del range lineare di rilevamento al fine di garantire la precisione della misurazione. </li></ol></li></ol>

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	<li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX+Phosphorylation:+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy.">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li><li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair.">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li><li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+DNA+replication:+from+nucleosomes+to+loop+domains.">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li><li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control.">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li><li>Bhaskara, S., Hiebert, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC1,2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li><li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair:+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers.">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li><li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. 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I have no competing financial interests.

Il protocollo descritto in questo manoscritto è un metodo relativamente veloce per dimostrare la presenza di proteine ​​o loro forme post-traduzionali modificati sul DNA appena replicato o nascente. Inoltre, questa tecnica permette uno per misurare la cinetica di associazione-dissociazione di una proteina o la sua forma modificata con il DNA nascente. Questa tecnica è complementare alla elegante tecnologia iPOND 13. Nella tecnologia iPOND, il DNA di nuova sintesi è etichettato con deossiuridina etile (...

Riparazione del DNA difettosa e / o replicazione del DNA sono una delle principali cause di instabilità genomica, che può innescare la morte cellulare. Un singolo non riparato doppia interruzione filo è sufficiente a causare la morte delle cellule 1. Organizzazione della cromatina è transitoriamente alterata sia in fase di replica e riparare 2,3, e l&#39;incapacità di mantenere le informazioni epigenetiche nel corso di questi processi si tradurrà in una minaccia per l&#39;integrità del genoma. Perdita di HDAC3 o della funzione HDAC1,2 impedisce progressione fase S, la replicazione e riparazione del DNA che porta a stress genotossico (danni al DNA) e la morte delle cellule 4-9. Si tratta quindi di una strategia pratica per usare inibitori HDAC selettivi di interrompere la replica, la riparazione e la cromatina in cellule tumorali e causare danni al DNA, che a sua volta può fermare la crescita e induce la morte cellulare selettivamente nelle cellule tumorali in rapida crescita. Durante la replicazione del DNA, cromatina è rapidamente smontato e poi rimontato seguendo duplicazione del DNA. Recentemente synthesized istone H4 è acetilato a K5 e residui K12 (H4K5K12ac) e segue la deposizione sulla cromatina, sono rapidamente deacetilata da istone deacetilasi (HDAC) 10,11. Fallimento di cellule per mantenere l&#39;integrità della cromatina nascente da istoni deacetilazione può portare al collasso della forcella, che a sua volta può causare danni al DNA e la morte cellulare. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;inibizione selettiva di HDAC1,2 aumenta l&#39;acetilazione degli istoni (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibisce l&#39;attività SMARCA5 cromatina remodeler sulla cromatina nascente, che correla con una ridotta progressione forca di replicazione, aumentato crollo forchetta e aumentato la replica da stress danno al DNA 6 . Così, HDAC inibitore trattamento possono alterare la struttura della cromatina nascente per innescare danni al DNA e la morte molto rapidamente nelle cellule tumorali, in quanto questi ciclo cellule in rapida e passare più volte attraverso la fase S. E &#39;quindi importante capire come funzionano HDAC regolare acetilazione degli istoni e proteine ​​binding per mantenere la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero. Per misurare quantitativamente la quantità di acetilazione degli istoni e SMARCA5 remodeler cromatina associata con il DNA nascente durante la replicazione del DNA, abbiamo ideato un saggio ChIP modificato chiamato la tecnica di BrdU-Chip-Slot-occidentale. Dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di una proteina o istone modifica desiderata, la quantità di DNA nascente (all&#39;etichetta analogico timidina, BrdU) nel campione chip può essere rilevato mediante analisi Western di DNA chip BrdU marcato trasferite su una membrana utilizzando un Slot Apparecchio Blot. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato che H4K16ac (un marchio coinvolta nella confezione cromatina) e il membro della famiglia ISWI SMARCA5 (regolatore actina-dipendente matrice associata SWI / SNF-correlata della cromatina) remodeler cromatina sono associati con il DNA nascente in cellule in fase S. 6. Abbiamo anche trovato che il marchio nascente H4K16ac è deacetilata da HDAC1,2 durante la replicazione del DNA 6. Inibisce H4K16acattività remodeler cromatina del familiare ISWI SMARCA5 12. Quindi, utilizzando la tecnica BrdU-CHIP-Slot-occidentale, potremmo collegare le funzioni per HDAC1,2 nel regolare il rimodellamento della cromatina durante la replicazione del DNA. Quindi, la tecnica BrdU-Chip-Slot-Western Blot è un approccio efficace per misurare quantitativamente l&#39;associazione e dissociazione dinamica delle proteine ​​o loro modificazioni post-traslazionali che sono tenuti al DNA nascente.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (westerns)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Protein A agarose</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Mallinckrodt GenAR&amp;nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson Sonifier&amp;nbsp; Digital Ultrasonic Cell Disruptor</td><td>Model: 450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>Model: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>Model: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td><td>ThermoScientific</td><td>Model: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot apparatus&amp;nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators</td><td></td></tr></tbody></table>

examination of proteins bound to nascent dna in mammalian cells using  brdu-chip-slot-western technique

Istone deacetilasi 1 e 2 (HDAC1,2) localizzano ai siti di replicazione del DNA. Nello studio precedente, utilizzando un inibitore selettivo e di un sistema atterramento genetica, abbiamo dimostrato le funzioni nuovi per HDAC1,2 nella progressione della forcella replica e nascente manutenzione cromatina in cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale che combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di bromo-deossiuridina (BrdU) DNA -labeled con macchia slot e occidentale analisi per misurare quantitativamente proteine ​​o modificazione degli istoni associati con il DNA nascente. Attivamente cellule in divisione sono state trattate con HDAC1,2 inibitore selettivo o trasfettate con siRNA contro HDAC1 e HDAC2 e quindi il DNA di nuova sintesi è stato etichettato con il bromodeossiuridina timidina analogico (BrdU). L&#39;etichettatura BrdU è stata fatta in un punto di tempo in cui non c&#39;era significativo arresto del ciclo cellulare o apoptosi a causa della perdita delle funzioni HDAC1,2. Seguendo lAbeling di cellule con BrdU, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di marchi di acetilazione degli istoni o la cromatina-remodeler è stata effettuata con anticorpi specifici. BrdU marcato DNA ingresso e l&#39;immunoprecipitato (o chip) DNA è stato poi trasferite su una membrana con la tecnica di slot blot ed immobilizzati mediante UV. La quantità di DNA nascente in ciascuno slot è stata poi valutata quantitativamente mediante analisi Western con un anticorpo anti-BrdU. L&#39;effetto della perdita di funzioni HDAC1,2 sui livelli di nuova sintesi degli istoni marchi acetilazione DNA associate e cromatina remodeler è stato quindi determinato normalizzando il segnale di BrdU-Chip ottenute dai campioni trattati ai campioni di controllo.

Per determinare la specificità degli inibitori selettivi HDAC1,2, sono stati utilizzati Hdac1,2 FL / FL e HDAC3 FL / FL cellule fibrosarcoma. -Adenovirus contenenti Cre ricombinasi (Ad-Cre) è stato utilizzato per eliminare Hdac1,2 e HDAC3 in queste cellule. A seguito di infezione Ad-Cre di Hdac1,2 FL / FL cellule, è stato osservato un robusto incremento della H4K5ac. Il trattamento dell...

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Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Esame di proteine ​​legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Views.  University of Utah School of Medicine. In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA. 

Video: Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Ricerca

Genetica

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Biochimica

Misurazione dei legami incrociati DNA-proteina ubiquitinati, SUMOilati e ADP-ribosilati

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

Autore in primo piano: Rilevamento quantitativo dei legami incrociati delle proteine del DNA e delle loro modifiche post-traduzionali  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Biologia

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs for cancer treatment. These targets are poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), which initiate various forms of DNA repair. Inhibiting these enzymes using PARP inhibitors (PARPi) achieves synthetic lethality by conferring a therapeutic vulnerability in homologous recombination (HR)-deficient cells due to mutations in breast cancer type 1 (BRCA1), BRCA2, or partner and localizer of BRCA2 (PALB2). 
Cells treated with PARPi accumulate DNA double-strand breaks (DSBs). These breaks are processed by the DNA end resection machinery, leading to the formation of single-stranded (ss) DNA and subsequent DNA repair. In a BRCA1-deficient context, reinvigorating DNA resection through mutations in DNA resection inhibitors, such as 53BP1 and DYNLL1, causes PARPi resistance. Therefore, being able to monitor DNA resection in cellulo is critical for a clearer understanding of the DNA repair pathways and the development of new strategies to overcome PARPi resistance. Immunofluorescence (IF)-based techniques allow for monitoring of global DNA resection after DNA damage. This strategy requires long-pulse genomic DNA labeling with 5-bromo-2&#8242;-deoxyuridine (BrdU). Following DNA damage and DNA end resection, the resulting single-stranded DNA is specifically detected by an anti-BrdU antibody under native conditions. Moreover, DNA resection can also be studied using cell cycle markers to differentiate between various phases of the cell cycle. Cells in the S/G2 phase allow the study of end resection within HR, whereas G1 cells can be used to study non-homologous end joining (NHEJ). A detailed protocol for this IF method coupled to cell cycle discrimination is described in this paper.

In the present protocol, we demonstrate how to visualize DNA double-strand end resection during S/G2 phase of the cell cycle using an immunofluorescence-based method.

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Esame di proteine legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

Studiare Ribonucleotide incorporazione: Strand-specifico rilevamento di ribonucleotidi nel genoma del lievito e mutagenesi indotta da Ribonucleotide di misura

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

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Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

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Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente

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In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

Esame di proteine legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale