Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation

Inizia ottenendo le uova di zebrafish wildtype e transgenico dalla rispettiva configurazione di allevamento. Prendi una capsula di Petri di 15 centimetri contenente terreno E3 o E3 tamponato con HEPES. E raccogli la quantità appropriata di uova fecondate dalla configurazione di allevamento del pesce zebra desiderata. Incubare le uova fecondate in E3 a 28 gradi Celsius con un ciclo di luce e buio appropriato.

A un giorno dalla fecondazione o dpf, rimuovere gli ovuli non fecondati e lasciare che quelli fecondati si sviluppino fino a cinque dpf. Seleziona le larve di zebrafish transgenico a un dpf. Prima di procedere alla dissociazione delle larve intere, anestetizzare le cinque larve dpf wildtype utilizzando lo 0,016% di tricaina e trasferire 30 larve anestetizzate in una capsula di Petri contenente un millilitro di soluzione 10x tripsina-EDTA.

Quindi, usando una lama di rasoio, tritare le larve in piccoli pezzi nella capsula di Petri. Trasferire le larve tritate in una provetta da microcentrifuga con due millilitri di soluzione 10x tripsina-EDTA e lasciare la provetta sul ghiaccio per tre ore. Pipettare il contenuto su e giù con una pipetta P1000 ogni ora per stimolare la dissociazione.