Lavare le cellule trattate sopra con PBS ghiacciato per rimuovere eventuali residui di terreno e aggiungere 50 microlitri del tampone di lisi RIPA contenente PMSF per lisare le cellule. Raccogli le cellule in una provetta. Incubare le cellule su ghiaccio per alcuni minuti per garantire una lisi completa, quindi centrifugare a quattro gradi Celsius a 12.000 g per 15 minuti.
Quindi mescolare il lisato cellulare con un tampone di carico e riscaldare la miscela a 95-100 gradi Celsius per 5-10 minuti a bagnomaria per denaturare le proteine. Caricare 10 microlitri di proteine totali da ciascun campione su un gel SDS0-PAGE. Far scorrere il gel a una tensione costante di 80 volt.
Interrompere l'elettroforesi quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel di separazione. Quindi utilizzare un sistema di trasferimento a umido in un bagno di ghiaccio per trasferire le proteine separate dal gel su una membrana di difluoruro di polivinilidene. Al termine del trasferimento, rimuovere la membrana e incubarla in un tampone bloccante a temperatura ambiente per circa un'ora.
Incubare la membrana con un anticorpo secondario coniugato a HRP. Visualizzare le bande proteiche sulla membrana utilizzando un substrato chemiluminescente e catturare il segnale utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza. L'analisi Western blot ha mostrato che l'espressione soppressa di FAM83A ha aumentato le proteine Bax e cleaved-caspasi-3, ha diminuito l'espressione di BCL-2 e ha aumentato il rilascio di citocromo c.
