Generazione di linee cellulari knockout CENP-E^-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

La delezione genetica di Kinesin-7 e CENP di solito provoca l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare. La costruzione di linee cellulari knockout stabili per CENP è un'importante questione irrisolta nella biologia CENP. In questo studio, abbiamo generato cellule HeLa knockout CENP utilizzando un sistema CRISPR/Cas9 e abbiamo stabilito tre strategie di screening ottimizzate.

Recentemente, diverse tecnologie di editing del genoma, tra cui le nucleasi a dita di zinco, le nucleasi effettrici simili ad attivatori di trascrizione e il modo in cui produciamo le nostre nucleasi, sono state progettate per scindere i genomi a una dimensione specifica. La tecnologia di knockout del gene CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato la biologia di base, la biotecnologia e la medicina. Il CENP è essenziale per attaccare i cinetocori ai microtubuli e allineare i cromosomi.

L'interruzione del CENP, attraverso la microiniezione di anticorpi, la delezione dello sgRNA, l'inibizione chimica o la delezione genetica, provoca disallineamento cromosomico, difetti mitotici e spesso morte cellulare, complicando lo studio dei meccanismi della proteina CENP. In questo studio, sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, l'allineamento cromosomico dei fenotipi e le intensità fluorescenti delle proteine CENP, che hanno migliorato l'efficienza dello screening e il tasso di successo sperimentale. È importante sottolineare che la delezione di CENP provoca il disallineamento cromosomico, la posizione anomala delle proteine BubR1 e difetti mitotici.

Le modalità di interazione e i meccanismi molecolari del CENP e dei suoi inibitori sono importanti campi di ricerca nella biologia cellulare e nella ricerca sul cancro. In questo studio, la linea cellulare CENP knockout HeLa è stata affermata come un valido strumento per la validazione della specificità e della tossicità degli inibitori di CENP.