1 Per iniziare, ottenere cellule di colorazione del ligando2 che esprimono la proteina di interesse con l'alone e l'alone H2B. 3 Dopo aver acceso il sistema del microscopio, 4 impostare i parametri di incubazione delle cellule vive 5 e lasciare che il sistema si equilibri. 6 Mettere una goccia di olio su 7 un obiettivo TIRF 100x sul microscopio 8 e caricare il campione di cellule sul tavolino del microscopio.
9 Per identificare una cellula morfologicamente sana, 10 regolare la posizione Z 11 e visualizzare il campione di cellula in campo chiaro. 12 Ritaglia il campo visivo per catturare il nucleo della cellula bersaglio. 13 Utilizzando l'illuminazione laser, regolare l'angolo TIRF 14 per ottenere l'illuminazione hilo con un rapporto segnale/rumore ottimale di 15 di una singola molecola.
16 Quindi, impostare il tempo di esposizione su 500 millisecondi. 17 Durante il tempo morto tra i fotogrammi, 18 fotoattivano le molecole 19 con un fascio di 111 microwatt a 405 nanometri, 20 e durante ogni esposizione, eccitano le molecole di alone H2B 21 con un raggio di 9,1 milliwatt a 640 nanometri. 22 Avviare l'acquisizione di immagini per 2000 fotogrammi in modo continuo 23 e aumentare gradualmente la potenza del raggio di 405 nanometri 24 dopo la riduzione delle molecole fotoattivate.
25 Per una proteina di interesse marcata con alone, 26 dividere le lunghezze d'onda di emissione tra due telecamere 27 utilizzando uno specchio dicroico a passaggio lungo. 28 Agli stessi parametri di acquisizione dimostrati in precedenza, 29 aggiungere il canale JFX549 per acquisire un fotogramma ogni 10 secondi 30 e catturare 2000 fotogrammi continuamente.
