1 Per iniziare, eseguire l'imaging di singole molecole su cellule vive2 dei condensati proteici HaloTag. 3 Utilizzando ImageJ, convertire ciascun canale 4 dal file di dati di imaging grezzi 5 in un file TIFF indipendente. 6 Se necessario, eseguire il pettine di pretracciamento.
Scrivi 7 e segui le istruzioni 8 per sostituire eventuali fotogrammi con quelli più recenti. 9 Per caricare la singola molecola del file del film in SlimFast, 10 fare clic su carica, seguito dalla pila di immagini. 11 Impostare i parametri per la localizzazione 12 e l'acquisizione nelle rispettive schede delle opzioni.
13 Visualizza le localizzazioni di tutte le molecole. 14 E usando lock all, 15 genera un file contenente le localizzazioni 16 di tutte le molecole in ogni fotogramma. 17 Quindi, vai su carica dati particella 18 e seleziona SlimFast per caricare il file 19 con le impostazioni di localizzazione e acquisizione.
20 Utilizzando l'opzione e l'inseguimento del foglio, 21 regolare i parametri per la generazione della traiettoria. 22 Cliccare su gen traj per generare un file 23 contenente le traiettorie di tutte le molecole. 24 Caricare il file tracciato del foglio in eval SPT 25 e impostare i parametri 26 per filtrare le traiettorie inferiori a 2,5 secondi.
27 Utilizzando i dati di esportazione, generare un file 28 con tutte le traiettorie filtrate. 29 Esecuzione della macro ImageJ, del nucleo, della 30 e della maschera cluster versione due. testo, soglia 31 tutti i fotogrammi del filmato acquisiti 32 nel canale JFX549 per generare un filmato time lapse 33 popolato con la maschera binaria in evoluzione temporale 34 che evidenzia le posizioni condensate.
35 Utilizzo della conversione ASCII tracciamento lento CSS 3. M, 36 riformatta le traiettorie 37 ed esegue la categorizzazione versione 4. M 38 per ordinarli in base al tempo di vita 39 che una molecola trascorre in un condensato.
40 Successivamente, utilizzando la residenza del terreno hist CSS. M, 41 estraggono il tasso di dissociazione osservato 42 di molecole specificamente legate 43 e il tasso di fotobleaching dalla proteina condensata 44 di interesse e le traiettorie H2B. 45 Infine, calcolare il tempo di permanenza medio corretto 46 della proteina di interesse, 47 specificamente legata ai suoi condensati.
48 Un fotogramma dal filmato a due colori a singola molecola 49 di TAF15 IDR-Halo-FTH1 mostra i segnali 50 dal nucleo in entrambi i canali PA-JF646 e JFX549. 51 Dopo l'assemblaggio e lo smistamento, 52 è stata osservata una chiara distinzione per le traiettorie 53 delle molecole di PA-JF646 rilevate legate ai condensati. 54 I tempi medi di permanenza calcolati 55 dopo la correzione per il fotobleaching 56 erano più per TAF15-Halo-FTH1 che per Halo-TAF15.
