Per iniziare, etichettare tre set di provette sterili da 1,7 millilitri e un set di provette sterili a fondo conico da 15 millilitri. Preparare una centrifuga a secchio oscillante con inserti per provette da 15 millilitri e pre-raffreddare a quattro gradi Celsius. Prendere la piastra di coltura cellulare a sei pozzetti con cellule 293FT trasfettate.
Aspirare i mezzi dai pozzi. Aggiungere 250 microlitri di tripsina-EDTA e incubare a 37 gradi fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Quindi aggiungere un millilitro di terreno di coltura integrato con FBS al 10% a ciascun pozzetto e pipettare energicamente per creare una sospensione a cellula singola.
Trasferire un millilitro di sospensione cellulare in provette da 15 millilitri pre-marcate. Aggiungere un millilitro di terreno di prova integrato con FBS al 10% a ciascuna di queste provette e capovolgere cinque volte per mescolare. Quindi trasferire immediatamente 20 microlitri di sospensione cellulare nel set di provette uno.
Centrifugare ora le provette da 15 millilitri per cinque minuti a 250 g in una centrifuga pre-raffreddata. Mescolare 20 microlitri di colorante di cellule blu di tripano con le cellule del set uno e contare utilizzando un contatore di cellule o un emocitometro. Dopo aver rimosso le provette da 15 millilitri dalla centrifuga, aspirare i terreni dai pellet cellulari e risospendere i pellet in terreni di saggio privi di siero per creare una sospensione a cellula singola.
Per reflare le cellule in piastre da 384 pozzetti e sei pozzetti, capovolgere più volte le provette da 15 millilitri per ottenere una sospensione cellulare omogenea e trasferire 500 microlitri in provette da 1,7 millilitri nel set due e nel set tre. Aggiungere 0,5 microlitri di DMSO per impostare due e 0,5 microlitri di ligando Halo 618 per il set di tubi tre e mescolare bene. Trasferire il DMSO e le sospensioni cellulari ligando-positive in pozzetti separati di serbatoi di reagenti.
Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 40 microlitri di ciascuna sospensione nella piastra di coltura a 384 pozzetti. Trasferire le cellule rimanenti in piastre di coltura fresche a sei pozzetti per la successiva analisi western blot e incubare entrambe le piastre a 384 pozzetti e a sei pozzetti durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Prelevare terreni di prova privi di siero preriscaldati a 37 gradi Celsius.
Diluire il substrato di nanoluciferasi scongelato 1:100 in un terreno di prova privo di siero e trasferirlo in un serbatoio di reagenti. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 10 microlitri di miscela di substrato in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 384 pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra per un minuto.
Inserire la piastra a 384 pozzetti in un lettore di piastre multimodale e registrare le emissioni di 460 e 618 nanometri da tutti i pozzetti con celle. Calcola i rapporti BRET grezzi per il veicolo positivo e il ligando positivo in unità milliBRET utilizzando l'equazione data. Calcola il rapporto BRET corretto sottraendo il rapporto BRET positivo al veicolo da quello del ligando-positivo.
Il mutante nano-CRAFS259A riduce il segnale BRET di circa il 45% e il mutante nano-CRAFS621A di circa il 25%Il doppio mutante elimina quasi completamente il segnale BRET.
