Questo lavoro è stato finanziato da un Istituto Nazionale di Ricerca dentale e craniofacciale (NIDCR) F32 concessione (DE021929) per JLF e una borsa di DE016402 NIDCR R01 per RAS

1. Preparare tungsteno aghi <ol><li> Tagliare una canna tungsteno a metà con tronchesi in modo che l&#39;asta non si piega. </li><li> Infilare l&#39;asta fino alla fine conica di un 5 3/4 in vetro borosilicato pipetta Pasteur. </li><li> Lasciando circa 3/4 della attaccare in asta dal vetro, aderire l&#39;asta alla punta della pipetta con una piccola quantità di &quot;hot melt&quot; (HMA), che è il bastone colla utilizzata per una pistola per colla. L&#39;HMA deve essere rapidamente sciolto in una fiamma di alcool, facendo attenzione a non bruciare la colla e generare fumo nero. </li><li> Usando un paio di pinze, piegare la punta della canna tungsteno (circa 1/4 in dall&#39;estremità superiore) fino a un angolo di 45 ° è raggiunto. </li><li> Tenendo la pipetta Pasteur, collocare circa 1/8 della punta della canna tungsteno nella fiamma di un bruciatore a gas propano. Tenere la punta costante e esattamente perpendicolare alla fiamma. </li><li> Estrarre l&#39;ago della fiamma del momento in cui un minuscolo granello arancione tungsdieci vola via dell&#39;ago. </li></ol> 2. Preparare Spemann Pipettes <ol><li> Utilizzando un becco Bunsen, riscaldare l&#39;estremità più stretta di una pipetta Pasteur finché il vetro poco oltre la conicità inizia a fondere. Togliere dal fuoco e tirare la punta fino a quando la pipetta viene sigillato. Assicurarsi che permane una porzione di sezione conica che ha un diametro esterno di circa 0,7-1,0 mm. Rompere l&#39;estremità sigillato circa 4 cm dal cono. </li><li> Attaccare circa 2 ft (60 cm) di tubo in gomma al largo (aperto) fine della pipetta. Soffiare sull&#39;altra estremità del tubo in gomma per assicurare che l&#39;aria può passare attraverso la sezione conica della pipetta Pasteur. </li><li> Utilizzando un cilindro combustibile propano con una torcia matita fiamma divisoria, riscaldare una superficie ovale su un lato della pipetta appena sotto l&#39;inizio del cono. Soffiare aria molto delicatamente e costantemente attraverso il tubo di gomma con una leggera pressione (circa la quantità di pressione necessaria per dire all&#39;inizio del letter &quot;P&quot; a livello di conversazione). Quando il vetro diventa morbido su un lato e comincia a deformarsi verso l&#39;esterno, rimuovere rapidamente la pipetta dalla fiamma e soffiare forte e costante attraverso il tubo di gomma. Questo farà sì che la parte riscaldata del vetro per formare una bolla a forma di salsiccia che possono pop, che va bene. Se la bolla è troppo piccola, prova fusione e soffiando di nuovo il bicchiere. La finestra aperta finale del bicchiere dovrebbe essere di circa 0,25 (6,35 mm) di larghezza per 0,5 in (12,7 mm) lungo. </li><li> Indicare l&#39;estremità rastremata verso l&#39;alto, raschiare la bolla in un contenitore di rifiuti di vetro mentre delicatamente soffia attraverso il tubo per evitare che frammenti di vetro di entrare nella pipetta. </li><li> Utilizzando la fiamma propano, bruciare le restanti bordi della bolla e fuoco-lucidi i lati della finestra aperta. Fare attenzione a non sciogliere l&#39;albero della pipetta. </li><li> Con una matita punta di diamante, segnare l&#39;estremità conica della pipetta circa 1,25 in (30 mm) dalla finestra e rompere la puntacon una pinza in modo che l&#39;apertura pipetta è tagliato in modo pulito (pipette di rigetto con punte rotte o irregolari). </li><li> Utilizzando pinze e il bordo di una fiamma di un bruciatore ad alcol, piegare la parte stretta della pipetta 0,375 in (9,5 mm) dalla punta di un angolo di circa 60 ° in modo che la porzione piegata è in un piano verticale quando l&#39;apertura della finestra è nella posizione 1:00 per l&#39;utilizzo mano destra e le 11:00 per l&#39;utilizzo con la mano sinistra. Questo passaggio è meglio condotto in un recinto privo di correnti. </li><li> Fuoco lucidare la punta con la fiamma di alcool sotto un microscopio da dissezione. Assicuratevi di non chiudere la punta, ma piuttosto mantenere l&#39;apertura rotonda e liscia, senza alcuna costrizione. </li><li> Tagliare un 1 (25 mm) pezzo di tubo di gomma, spruzzare il pezzo di tubo con il 70% di etanolo, e far scorrere il tubo sull&#39;albero della pipetta fino all&#39;apertura della finestra è completamente coperto. Questo funziona come il &quot;diaframma&quot; della pipetta Spemann. </li><li> Posizionare una lampadina lattice di gomma 2 mlsopra il fondo aperto della pipetta. La lampadina mantiene la pressione negativa nella pipetta Spemann. </li><li> Per pratica utilizzando una pipetta Spemann, perle trasferimento cromatografia di circa 100-200 micron di diametro da una marcata posto in una capsula di Petri a un marcato posto in un&#39;altra sotto un microscopio. </li><li> Per pulire la pipetta Spemann, rimuovere il gommino e pipetta, punta verso il basso, in un bicchiere alto foderato con cotone o garza sul fondo e riempito con acqua distillata e detergente cristalleria. </li></ol> 3. Sterilizzare e incubare uova <ol><li> Pulire le uova con il 70% di etanolo e mettere le uova su vassoi di uova di plastica. </li><li> Impostare uova in una incubatrice riscaldata a 37,5 ° C e 85-87%. </li><li> Incubare le uova fino a raggiungere HH9.5, circa 26 ore per le quaglie e 48 ore per l&#39;anatra. </li></ol> 4. Uova Finestra <ol><li> Rimuovere un piccolo pezzo di guscio esterno dalla parte superiore dell&#39;uovo con una pinza, facendo attenzione a non forare la calotta interna membrane. </li><li> Usando una siringa con un 18 G da ago da 1 pollice, fare un buco sulla punta stretta dell&#39;uovo e prelevare circa 1-2 ml di albume. </li><li> Posizionare il nastro trasparente sopra il foro e segnare puntura nel guscio. </li><li> Tagliare una &quot;finestra&quot; lungo la superficie superiore dell&#39;uovo (attraverso il nastro trasparente) usando forbici curve. </li></ol> 5. Visualizza embrioni e preparare per la chirurgia <ol><li> Utilizzando una bacchetta di vetro, spazzolare delicatamente una piccola quantità di rosso neutro (0,02 g / ml in BSS di Hank) sopra l&#39;embrione. </li><li> Tagliare la membrana vitellina e tirarlo sopra l&#39;embrione utilizzando un ago di tungsteno-affilata fiamma. </li><li> Ri-sigillare l&#39;uovo posizionando il nastro trasparente sulla finestra. </li></ol> 6. Separare il tessuto dei donatori dall&#39;embrione Donor <ol><li> Rimuovere il nastro dalla finestra sull&#39;uovo dell&#39;embrione donatore. </li><li> Per tagliare la piega neurale dall&#39;ectoderma adiacente dell&#39;embrione donatore, fare tagli su entrambi i sides del tubo neurale, utilizzando un ago di tungsteno affilate fiamma (fabbricato come descritto sopra). </li><li> Poi, tutto il taglio del tubo neurale anteriore e posteriore livelli dell&#39;innesto desiderate e separare l&#39;innesto dal resto del tubo neurale. </li><li> Rimuovere la piega neurale dall&#39;embrione donatore utilizzando una pipetta Spemann o altro tipo di micropipetta. </li><li> Poi, rimuovere il nastro dalla finestra sull&#39;uovo host e utilizzare la pipetta Spemann per posizionare il donatore neurale piega lungo l&#39;embrione ospite adiacente alla regione del tubo neurale che riceverà il trapianto. </li></ol> 7. Separare il tessuto ospite e Trapianti tessuto del donatore <ol><li> Separare la piega neurale dal tubo neurale dell&#39;embrione ospitante, come fatto con il donatore. Fate attenzione a rimuovere un innesto di pari dimensioni come il tessuto del donatore. </li><li> Spingere delicatamente questo tessuto ospite lontano dal embrione. </li><li> Poi, con un ago di tungsteno smussato o la punta arrotondata di un micropipette, spostare delicatamente il neurale donatore piega nel tubo neurale ospitante, mantenendo gli orientamenti antero-posteriore e dorso-ventrale corretta. Assicurarsi che l&#39;innesto è nascosto in lungo i lati, ma essere sicuri di non colpire o danneggiare i tessuti sottostanti. Per tenere traccia della nota orientamento originale qualsiasi asimmetria nel tessuto donatore o colorazione differenziale dal rosso neutro. Abbiamo anche foto-documento l&#39;embrione donatore con il tessuto asportato accompagnamento, nonché la chimera immediatamente dopo l&#39;intervento. </li><li> Salina sterile deve essere aggiunto l&#39;uovo se l&#39;embrione host mostra segni di disseccamento. </li><li> Ora, accuratamente ri-tenuta ed etichettare l&#39;uovo, e delicatamente ritorno ad un incubatore alto tasso di umidità (70-80%), dove l&#39;embrione chimerico può sviluppare alla fase desiderata per l&#39;analisi. </li></ol> 8. Insieme di Chimere <ol><li> Assicuratevi di raccogliere embrioni chimerici in appena fatta fissativo freddo di Serra e subito metterli su un rocker a 4 ° C per una fissazione O / N. Ciò consentirà di rilevamento più sensibile di cellule quaglia con l&#39;anticorpo anti-quaglia. </li><li> Per analisi dell&#39;espressione genica mediante RT-qPCR, congelare embrioni direttamente in azoto liquido prima estrazione di RNA. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La cresta neurale è una popolazione di cellule embrionali transitoria che migra estesamente durante l&#39;embrione e differenzia in tipi cellulari diversi, compresi condrociti e osteoblasti, che contribuiscono allo scheletro craniofacciale. Trapianto cresta neurale nel sistema chimerico quaglia-duck ha contribuito notevolmente alla nostra comprensione delle interazioni dei tessuti e vie di segnalazione che regolano lo sviluppo dello scheletro cranio-facciale. Tuttavia, dato il vasto potenziale della cresta neurale di generare anche le cellule muscolari lisce, adipociti, melanociti, cellule di Schwann e neuroni, il sistema chimera quaglia, anatra ha un enorme potenziale per le applicazioni future, in particolare in concomitanza con il rapido avanzamento della biologia delle cellule staminali e la medicina rigenerativa. Poiché quaglia e anatra sono entrambe le specie allevate in commercio, una pronta fornitura di uova fecondate relativamente poco costoso è disponibile da una varietà di aziende. Così, questa tecnica dovrebbe essere accessibile a Researcil suo operare all&#39;interno di una vasta gamma di budget e spazio struttura. Sebbene questa tecnica è molto potente, rimangono diverse limitazioni. Come altre tecniche chirurgiche, la qualità e la vitalità delle chimere quaglia, anatra contare sulle abilità chirurgica del ricercatore, e, quindi, non ci saranno più variazioni inter-e intra-individuale tra esperimenti, rispetto ad altri modelli, come quelli che utilizzano il mouse genetica. Inoltre, vi è anche una variazione nel tasso di sviluppo e modulazione di singoli embrioni che contribuisce alla riproducibilità e il successo di ogni trapianto. Embrioni di uccelli sono molto sensibili alla disidratazione e quindi passaggi critici durante la chirurgia includono mantenere i livelli di luce bassa, il tempo sotto il microscopio al minimo, le uova chiuse con nastro, per quanto possibile, e alta umidità nell&#39;incubatrice post-operatorio per evitare l&#39;essiccamento. In termini di redditività delle chimere, usually tra il 50-75% sopravvive, anche se queste percentuali possono diminuire il più vecchio fase di raccolta. In una tipica sessione di 4-6 ore di intervento chirurgico, un chirurgo esperto in grado di generare 10-15 chimere. Il successo dei trapianti dipende anche molto dalla qualità degli strumenti. Buoni strumenti portano a più coerenti, risultati riproducibili. Utilizzando un cannello a gas propano per fare gli aghi di tungsteno permette aghi estremamente nitide da effettuare. Il tipo di torcia utilizzato fa una grande differenza perché controlla la dimensione della fiamma. Affilatura elettrolitica può essere utilizzato anche, ma questo approccio non si avvicina nemmeno alla produzione di aghi taglienti. Utilizzare aste tungsteno invece di filo avvolta in modo che gli aghi possono essere fatte direttamente. La micropipetta Spemann, mentre in termini di tempo e difficile da fare, è uno strumento ideale per il trasferimento dei tessuti. La pipetta può essere personalizzato con aperture di dimensioni diverse, e può essere usato ripetutamente. Un fattore critico per usinga Spemann micropipetta è avere qualche liquido nella pipetta prima di toccare la punta alla superficie dell&#39;embrione. Alcuni del fluido sarà sempre fuoriuscire quando entra in contatto con il menisco sopra l&#39;embrione. Premendo sulla membrana permette tessuto fluido e innesto di essere espulso con estrema precisione, mentre leggermente cedimento sul diaframma succhia delicatamente il trapianto di tessuto donatore nella pipetta. Il mantenimento di un po &#39;di pressione positiva sul diaframma mantiene l&#39;innesto di tessuto donatore sulla punta della pipetta durante il trasferimento, e un po&#39; la pressione sulla membrana permette l&#39;innesto di tessuto donatore essere posto deliberatamente nell&#39;ospite. Per la protezione della pipetta Spemann durante lo stoccaggio e la sterilizzazione, togliere la lampadina dalla estremità larga e con attenzione inserire la punta affusolata nel bulbo. Posizionare la pipetta Spemann in una provetta di vetro, coprire la parte superiore con un foglio di alluminio, e sterilizzare in autoclave prima dell&#39;intervento. Dopo più pipette sono ready essere sterilizzato di nuovo per la chirurgia, invertire le pipette, riscaldarle quasi a ebollizione nella stessa soluzione di acqua distillata e detergente vetro, e quindi risciacquare più volte con acqua distillata. Pipette Autoclave nei loro singoli tubi. Il tubo di gomma che forma il diaframma e il gommino deve essere sostituito dopo diverse sterilizzazioni o quando diventano oscurata e rigida. Molti dei componenti di questo protocollo coinvolgono attrezzature pericolose. Ad esempio, la procedura per fare un Spemann Micropipetta prevede tre tipi di fiamme, così come il riscaldamento, tirando, soffiando, piegatura, taglio e lucidatura del vetro. Pertanto, indossando un equipaggiamento di protezione individuale (DPI), che aumenta la sicurezza come occhiali e un camice da laboratorio è critica. Inoltre, poiché molte persone soffrono, o che hanno il potenziale per sviluppare, allergie uovo, usare sempre i guanti quando si maneggiano le uova. Con queste precauzioni in mente, il sistema chimerico quaglia, anatra iSA metodo sicuro, efficace, e relativamente accessibile che ha molte applicazioni future.

Lo scheletro facciale sviluppa dalla crescita e fusione di più processi facciali che sono costituiti da cresta neurale e mesodermica mesenchima circondato da ectodermica e endodermico strati epiteliali 1-11. Eventi morfogenetici all&#39;interno di ogni processo sono disciplinate dalle interazioni segnalazione distinte tra mesenchima e epiteli circostanti 12-16. Modifiche di queste interazioni di segnalazione e / o dei loro effettori a valle contribuiscono a fenotipi della malattia e possono anche essere rilevanti per l&#39;evoluzione dello scheletro cranio-facciale 17, 18. Pertanto, chiarire i tempi e la natura delle interazioni dei tessuti ha un grande potenziale per aumentare la nostra comprensione della biologia dello sviluppo ed evolutiva dello scheletro facciale. L&#39;uso di embrioni chimerici per studiare le interazioni dei tessuti ha una lunga storia nella biologia dello sviluppo. Questo approccio è stato lanciato da Hans Spemann e il suo laboratorioche ha scoperto embrionali &quot;organizzatori&quot; di trapianto dei tessuti tra gli embrioni di diverse specie di anfibi. Spemann era un maestro di tecniche micro-chirurgiche la cui mano-competenze sono state integrate dal suo sviluppo di strumenti specializzati, in particolare la pipetta Spemann. Viktor Hamburger era uno studente laureato nel laboratorio di Hans Spemann a Friburgo nel corso del 1920, che è quando sono stati eseguiti gli esperimenti di trapianto originali che hanno portato il Premio Nobel Spemann. Quando Hamburger trasferì a Washington University di St. Louis nel 1935, ha dettagliato il processo di creazione di una micropipetta Spemann nel suo Manuale di Experimental Embryology 19. Drew Noden era uno studente laureato nel laboratorio di Hamburger alla Washington University fino al 1972. Dopo essersi trasferito alla University of Massachusetts, Amherst e poi a Cornell University, Noden continuato fabbricazione e l&#39;utilizzo di micropipette Spemann per i suoi trapianti chirurgici che coinvolgono chimere quaglia-chick. &amp;# 160;. Mentre uno studente laureato, uno degli autori (Rich Schneider) addestrati, con Drew Noden alla Cornell 1995-1998 Il seguente protocollo per fare una micropipetta Spemann è basato sulle descrizioni scritte da Hamburger e Noden, e comprende successive modifiche apportate by Schneider. L&#39;uso di chimere quaglia-chick per lo studio dello sviluppo cranio-facciale e soprattutto per comprendere i contributi di cellule della cresta neurale è stato lanciato da Noden e Le Douarin nei primi anni 1970, rivisto a Le Douarin et al 20. Questo approccio è stato largamente adottata in molti studi e da numerosi altri ricercatori 1, 4, 5, 21-38. I tassi equivalenti di crescita e la morfologia della quaglia e pulcino fanno trapianti al loro interno ideale per lo studio del destino delle cellule e lineage tracing. Tuttavia, a causa delle somiglianze tra quaglie e pulcino, cambiamenti morfologici induced da cellule del donatore sono difficili da decifrare. Al contrario, altri sistemi chimerici aviaria hanno incluso anatra domestica come un modo per studiare i meccanismi che fanno gli embrioni anatomicamente distinti 39-50. Più in particolare, il sistema chimerico quaglia-duck offre molteplici vantaggi per discernere gli effetti del donatore sull&#39;host, e viceversa. In primo luogo, quaglia e anatra embrioni sono distinti in termini di dimensioni del corpo e la forma, che fornisce un modo diretto per esplorare donatori-o meccanismi specifici dell&#39;host di formazione del pattern testando per i domini differenziali di espressione genica (Figure 1 A e B). In secondo luogo, quaglie e anatre embrioni hanno notevolmente diversi tassi di maturazione, con quaglia cova in 17 giorni e anatra cova in 28 giorni. Trapiantato cresta neurale mantiene il suo tasso di maturazione intrinseca all&#39;interno dell&#39;ambiente ospite, e, quindi, l&#39;identificazione di cambiamenti temporali nell&#39;espressione genica, interazioni di tessuto, istogenesi e morfogenesi è possibile51-57. Infine, l&#39;anticorpo anti-nucleare quaglia (Q ¢ PN) consente donatori e ospitare contributi cellulari siano permanentemente distinti l&#39;uno dall&#39;altro riconoscendo una proteina che è ubiquitariamente espresso in cellule quaglia ma assente da cellule anatra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

La generazione di embrioni chimerici è un approccio diffuso e potente per studiare destini cellulari, interazioni tessuti, e contributi specie-specifici per l&#39;istologico e sviluppo morfologico degli embrioni dei vertebrati. In particolare, l&#39;uso di embrioni chimerici ha stabilito l&#39;importanza della cresta neurale nel dirigere la morfologia specie-specifico del complesso craniofacciale. Il metodo descritto utilizza due specie aviarie, anatre e quaglie, con notevolmente diversa morfologia cranio-facciale. Questo metodo facilita notevolmente la ricerca di regolazione molecolare e cellulare del modello di specie-specifico nel complesso cranio-facciale. Esperimenti di quaglia e anatra embrioni chimerici hanno già rivelato interazioni dei tessuti neurali cresta-mediata e comportamenti cellule autonome che regolano specie-specifico modello nello scheletro cranio, muscolatura e tegumento. La grande diversità dei derivati ​​neurali della cresta suggerisce un potenziale significativoper le applicazioni future del sistema chimerico quaglia-anatra alla comprensione dello sviluppo dei vertebrati, la malattia, e l&#39;evoluzione.

Prima di ulteriori analisi, l&#39;efficienza del trapianto deve essere dosati. Per istologico, espressione morfologica, o gene analisi su campioni di tessuto, cellule quaglia devono essere rilevati mediante immunoistochimica utilizzando anticorpi Q ¢ PN come descritto 36. Per RNA analisi, i contributi specie-specifiche per i tessuti di interesse possono essere calcolati utilizzando una strategia basata sulla PCR 58. Dopo l&#39;efficacia del trapianto è stata convalidata, altre misure di esito morfologici o molecolari possono essere valutati in chimere. Le interazioni tra i donatori cellule della cresta neurale e tessuti dell&#39;ospite-derivati ​​e dintorni che sono alla base corretta istogenesi e la morfogenesi del complesso cranio-facciale hanno già stati ampiamente studiati. In particolare, neural crest mesenchima dirige specie-specifica morfologia del viso 7, 13, 51, 59, piuma modello 52, modello muscolare 56 </s<html> up&gt;, e la cartilagine 53, 57 attraverso la regolazione dell&#39;espressione genica host. Ad esempio, neural crest mesenchima determina quando le forme osso nella mandibola da temporalmente regolazione dell&#39;espressione Bmp4 55. Recentemente, le indagini si sono concentrate sulle interazioni dei tessuti che si verificano molto presto nello sviluppo craniofacciale. A questo proposito, gli esperimenti che utilizzano chimere quaglia-anatra hanno dimostrato embrioni di accoglienza influenzano la migrazione cresta neurale, determinando i limiti morfologici. Cioè, in embrioni chimerici quck, cellule della cresta neurale quaglia donatore migrano nell&#39;ospite arco anatra mandibolare in un modello duck-like (Figura 1D). Nonostante questo contributo ospitante alla dimensione della popolazione cresta neurale, il donatore cresta neurale continua a generare uno scheletro mandibolare che è quaglie simile per forma e dimensioni (Figura 1E). e 1 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Quaglia-Anatra chimerico sistema. (A) Quaglia e (B) crani anatra mostrano notevoli differenze di forma e dimensione, e, quindi, sono ideali per l&#39;utilizzo di un sistema chimerico per studiare lo sviluppo craniofacciale (modificato da Tokia et al. 56). (C) progettazione sperimentale per la generazione di unilaterali embrioni chimerici quck dal palco corrispondenza HH9.5 quaglia ed embrioni di anatra. La piega neurale viene rimosso da un lato di embrioni di quaglia e trapiantate in embrioni di anatra dopo un pezzo della piega neurale equivalente è stato rimosso. (D) cellule Quail donatore (verde) può essere seguita in chimere usando un anticorpo anti-quaglia (Q ¢ PN) come mostrato in vista ventrale di HH12 embrioni chimerici. (F) In mandibole quck al HH38, la quaglia donatore-derivati ​​Meckel7; s cartilagine è più corto e più dritto di quella osservata per l&#39;anatra cartilagine controlaterale ospitante derivato di Meckel, che è più grande e curvo. Ristampato Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007), con il permesso di Elsevier.

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Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Questo articolo descrive un metodo per generare embrioni chimerici che sono progettati per testare i contributi specifici per specie di cresta neurale e / o di altri tessuti per lo sviluppo craniofacciale.

Valutare Contributi specie-specifiche per lo sviluppo craniofacciale Uso Chimere Quaglia-anatra

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  University of California at San Francisco.  Questo articolo descrive un metodo per generare embrioni chimerici che sono progettati per testare i contributi specifici per specie di cresta neurale e / o di altri tessuti per lo sviluppo craniofacciale. 

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Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Sviluppo di nuove applicazioni terapeutiche Utilizzando Microfluidica

Ricerca

Biologia

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

In vivo Bioluminescent Imaging dei tumori mammari che usano lo spettro IVIS

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation di embrioni Medaka e trapianto di cellule per la generazione di chimere

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

Chiuso Sistema Cultura protocollo cellulare con imbarcazioni HyperStack con la tecnologia dei materiali gas permeabili

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Un approccio semi-quantitativo per valutare la formazione di biofilm mediante lo sviluppo spiegazzato Colony

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Conversione di un ELISA Capture ad un saggio Luminex xMAP utilizzando un anticorpo Multiplex metodo di screening

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Valutare Murino Resistenza Funzione Arteria Utilizzando myography Pressione

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...