Il metodo visualizza e quantifica la capacità delle cellule tumorali di delaminato e invadere, potendo così valutare la loro aggressività metastatica prima della formazione dell'azione o delle metastasi. Che il punteggio si basa sul processo di delaminazione come prerequisito per la formazione di metastasi, ottenendo così informazioni sull'aggressività metastatica delle cellule in modo relativamente veloce, facile ed economico. Pratica i diversi passaggi individuali prima di iniziare l'esperimento vero e proprio.
Il test CAM-Delam comprende diversi passaggi tecnici che sono difficili da spiegare per iscritto e molto più facili da apprezzare e imparare con la dimostrazione visiva. Per iniziare posizionare il numero desiderato di uova in vassoi per uova e incubare le uova di pulcino orizzontalmente in un'incubatrice per uova. Quindi sterilizzare 30 barche pesate e 30 piccole scatole di plastica con tappi trasparenti spruzzando il 70% di etanolo.
Quindi, asciugare le barche e le scatole di pesatura in una cappa laminare durante la notte e conservare in una scatola di plastica chiusa fino a un ulteriore utilizzo il terzo giorno di incubazione. Sterilizzare due litri di acqua distillata o deionizzata per 30 uova incubate, due paia di forbici e tre paia di pinze. In primo luogo, aggiungere circa 50 millilitri di acqua sterilizzata alle scatole di plastica sterilizzate e chiudere i coperchi.
Il terzo giorno di incubazione, rompere il guscio d'uovo usando la parte affilata delle forbici e tagliare un'apertura diritta nel guscio. Dopo aver aperto manualmente il guscio d'uovo su una barca di pesatura, raccogliere l'albume, il tuorlo e l'embrione sano attaccato nella barca di pesatura. Quindi cerca un embrione intatto con un cuore pulsante, un tuorlo intatto e vasi sanguigni sviluppati per l'esperimento.
Quindi, trasferire delicatamente la barca di pesatura in una camera interna umidificata e incubare la camera umidificata interna nell'incubatrice per uova. Per preparare anelli in silicone, tagliare un tubo di silicone con un diametro interno ed esterno di quattro millimetri e cinque millimetri rispettivamente in circa un millimetro di spessore, preferibilmente utilizzando un tagliacarte. Quindi trasferire gli anelli di silicone in piccole bottiglie di vetro.
Copriteli con un foglio di metallo e sterilizzateli con un'autoclave o simile. Conservare gli anelli sterili in silicone a temperatura ambiente. Coltivare le linee cellulari tumorali di interesse nel relativo mezzo di coltura in coltura cellulare.
Quindi preparare un millilitro di miscela di collagene RPMI e tenerlo sul ghiaccio. Successivamente, tripsinizzare le cellule tumorali per isolare le cellule rimuovendo prima il terreno di coltura cellulare e lavando. Quindi aggiungere tre millilitri di soluzione di tripsina per piatto di coltura cellulare di 15 centimetri di diametro e incubare per due o tre minuti in un incubatore di colture cellulari fino a quando le cellule si staccano.
Usando un microscopio invertito da tavolo, vedere le cellule staccate. Quindi inattivare la tripsina aggiungendo cinque millilitri di mezzo RPMI completo a ciascun piatto di coltura cellulare e raccogliere la sospensione cellulare da tutte le piastre di coltura cellulare in un tubo da 50 millilitri. Per contare le cellule tumorali, aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a 10 microlitri di colorazione blu tripano allo 0,4%.
Dopo aver miscelato il campione mediante pipettaggio su e giù alcune volte, caricare 10 microlitri della miscela cellulare per camera nel vetrino del campione nel contatore delle celle. Quindi, centrifugare la sospensione di coltura cellulare del volume corretto in un tubo da 50 millilitri a 500 volte G per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, mescolare il pellet cellulare con un millilitro della miscela di collagene RPMI.
Una volta che le cellule sono state mescolate con una pipetta da un millilitro, mantenere la sospensione cellulare preparata sul ghiaccio. Il giorno di incubazione 10, estrarre le camere interne umidificate con le uova incubate senza guscio dall'incubatrice. Dopo aver aperto la camera interna umidificata, posizionare fino a sei anelli in silicone sul CAM utilizzando una pinza sterilizzata.
Una volta che la sospensione delle cellule tumorali viene miscelata mediante pipettaggio per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule tumorali, aggiungere 20 microlitri della sospensione di cellule tumorali preparata all'interno di un anello di silicone. Dopo aver chiuso la camera interna umidificata, metterla nell'incubatrice delle uova. Dopo 14 ore, 1,5 giorni, 2,5 giorni e 3,5 giorni di incubazione, estrarre circa sette camere interne umidificate aprendo i coperchi uno alla volta.
Con un paio di forbici, sezionare le cellule tumorali coltivate attaccate al CAM tagliando all'esterno l'anello di silicone. Quindi trasferire immediatamente il campione ISOLATO CAM-Delam utilizzando una pinza al 4% di paraformaldeide in tampone fosfato molare 0,1 in una capsula di Petri per la fissazione del tessuto e tenere sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi, rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e aggiungere il 30% di saccarosio in tampone fosfato molare 0,1 ai campioni CAM-Delam ed equilibrare a quattro gradi Celsius per un'ora.
Al microscopio di dissezione, rimuovere con attenzione l'anello di silicone usando una pinza. Quindi, tagliare il campione CAM-Delam in una forma rettangolare con le cellule tumorali nel mezzo usando un paio di forbici. Quindi trasferire i campioni CAM-Delam su un mezzo di sezione congelato in una capsula di Petri per rimuovere il saccarosio in eccesso e quindi su stampi incorporati nel mezzo di sezione congelato con un paio di pinze.
Sotto un microscopio di dissezione, posizionare il campione CAM-Delam a forma di U in una reazione verticale negli stampi di incorporamento utilizzando qualsiasi strumento aghiforme e conservare i campioni CAM-Delam a 80 gradi Celsius. Quindi sezionare i campioni CAM-Delam congelati a 10 micrometri su cinque o sei diapositive consecutive utilizzando la criosezione. Per prima cosa, fai una linea con un marcatore idrofobo sulle diapositive dove terminano le sezioni e lasciale asciugare per alcuni minuti.
Quindi posizionare i vetrini in una camera umidificata e coprire le sezioni con circa 200-500 microlitri di soluzione bloccante e incubare per 15-30 minuti. Dopo aver versato la soluzione bloccante, sostituirla con 100-150 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito nella soluzione bloccante e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Allo stesso modo, dopo aver versato la soluzione anticorpale primaria, trasferire i vetrini nelle cuvette di vetro e lavare almeno tre volte per cinque minuti ciascuno in TBST.
Quindi, rimuovere il TBST in eccesso dal vetrino e dall'area della barriera idrofobica con un fazzoletto di carta morbida e coprire il vetrino con 100-150 microlitri di un anticorpo fluorescente secondario adatto diluito in soluzione bloccante combinato con DAPI. Incubare la diapositiva al buio a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver versato la soluzione anticorpale secondaria, trasferire i vetrini nelle cuvette di vetro e lavare almeno tre volte per cinque minuti ciascuno in TBST.
Quindi rimuovere l'eccesso di TBST dal vetrino e dall'area della barriera idrofobica con un fazzoletto di carta morbida. Quindi, montare le diapositive mettendo una o due gocce di mezzo di montaggio fluorescente sulla diapositiva e posizionare delicatamente un coperchio di vetro evitando bolle d'aria. Fotografare le sezioni utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di fotocamera digitale, preferibilmente con ingrandimento 10 X e analizzare le sezioni utilizzando le seguenti categorie di punteggio CAM-Delam come descritto nel manoscritto.
L'uso di camere interne umidificate ha migliorato significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni di pulcino da meno del 50% fino al 90% al giorno di incubazione 10 e da circa il 15% fino all'80% al giorno di incubazione 13. I risultati mostrano che la capacità delle cellule tumorali di degradare la lamina basale e invadere il mesenchima può essere valutata in quattro categorie tra cui lamina basale intatta senza alterazioni visibili, lamina basale alterata ma non danneggiata, lamina basale danneggiata senza invasione cellulare e lamina basale danneggiata con invasione cellulare. La colorazione anticorpale contro il fattore di von Willebrand mostra che la CAM è stata anche ispessita con un aumento della formazione dei vasi sanguigni quando le cellule tumorali hanno causato una lamina basale alterata o danneggiata.
Tuttavia, nessuno di questi due fenotipi è stato osservato quando la CAM era intatta. Le cellule PC-3U hanno indotto laminina danneggiata dopo 1,5 giorni con chiara invasione dopo 2,5 giorni. Al contrario, le cellule U251 hanno indotto solo lievi alterazioni della laminina dopo 1,5-3,5 giorni, ma non hanno mai causato alcun danno visibile alla laminina.
Dopo il trattamento con cloruro di cobalto, le cellule tumorali non metastatiche U251 hanno acquisito la capacità di indurre delaminazione e cellule invasive, che sono state soppresse quando combinate con l'inibitore MMP, GM6001. Non danneggiare il CAM con la punta della pipetta durante la semina delle cellule tumorali poiché tale danno della membrana distruggerà le letture del test. Una possibilità futura è quella di ottimizzare il metodo CAM-Delam per determinare le proprietà metastatiche nei campioni tumorali clinici, che potrebbero in futuro integrare la stadiazione delle metastasi del nodo tumorale utilizzata oggi.
