Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere 1R21NS064412, concessione NSF 1.052.048 e Jeffress Memorial Trust concessione J-908.

1. Preparazione del campione Nota: In molti casi gli esperimenti di perfusione lavare via una porzione significativa di cellule, che può diventare un problema frustrante. Sebbene non necessario per tutte le linee cellulari, superfici di vetro coperchio rivestimento con poli-L-lisina (aggiungere 1,0 ml/25 cm 2 di soluzione 0,01% in superficie, incubare&gt; 5 min, lavare due volte con acqua di grado coltura cellulare, e secco l&#39;armadio biosicurezza) migliora l&#39;adesione cellulare. Inoltre, essere consapevoli del livello di biosicurezza (BSL) della linea cellulare utilizzata, e seguire la procedura operativa standard approvato dall&#39;ufficio di salute e sicurezza ambientale locale. In questo esperimento, le cellule COS7 stati usati a causa della bassa attività di trasporto glutammina endogena (vedi Figura 4). <ol><li> Seme cellule COS7 a ~ 70-80% di confluenza in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + siero di vitello cosmica 10% e 100 U / ml di penicillina / streptomicina, sia su sterili 25 millimetri vetrini coprioggetto posti in coltura da 6 pozzettipiatto o 8 pozzetti vetrini con fondo di vetro. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità per 24 ore. </li><li> Scambiare il mezzo di crescita per DMEM siero di vitello cosmici +10% (antibiotici), secondo il protocollo del produttore. Grow O / N a 37 ° C, 5% CO 2 al 100% di umidità. </li><li> Aggiungere 0,4 mg ciascuna di DNA plasmidico codificante il sensore glutammina (pcDNA3.1, portando sensore FLIPQTV3.0 sotto promotore CMV 10) e il ASCT2 mCherry-tag 10 a 50 ml terreni privi di siero (OPTI-MEM) e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione a 50 ml terreni privi di siero. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Mescolare le due soluzioni contenenti DNA (fase 1.3) e reagente di trasfezione (passo 1.4) e incubare per 20 min. </li><li> Aggiungere delicatamente il reagente di trasfezione sulla parte superiore delle cellule e mescolare delicatamente a dondolo camera. Incubare per 24 ore a 37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità. </li><li> Dopo 24 ore, scambiare il mezzo di DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unità di penicillina / streptomicina. </li><li> Le cellule vengono esposte 48-72 ore dopo la trasfezione. </li></ol> 2. Esperimento perfusione Nota: Per le cellule COS7 utilizzati in questo esperimento, i media di perfusione e la camera sono stati mantenuti a temperatura ambiente e la concentrazione di CO 2. Tuttavia, se le cellule in uso richiedono una temperatura più alta e CO 2 di controllo della concentrazione per la sopravvivenza, palco microscopio riscaldamento e / o una camera ambientale dovrebbe essere usato. <ol><li> Preparare perfusione tampone AF (Vedere elenco dei materiali). Fissare rubinetti a 50 ml siringhe, chiudere i rubinetti poi riempirli con le soluzioni di perfusione. Aprire il rubinetto per un breve periodo ad occupare lo spazio di testa del rubinetto con il tampone. </li><li> Accendere il 8 canali, sistema di perfusione a gravità con una matita perfusione, e quindi selezionare &quot;Modalità manuale&quot; sotto Selezionare l&#39;opzione Function. Posizionare un contenitore di rifiuti sotto la matita perfusione. </li><li> Manualmenteattivare le porte premendo i numeri corrispondenti e riempire i tubi con siringa da 10 ml contenente acqua, e poi chiudere la porta. Una volta che le porte sono riempite con acqua, impostare le siringhe contenenti tamponi AF sulla porta 1-6 del sistema di perfusione, e quindi aprire i rubinetti. Aprire nuovamente le porte per sostituire l&#39;acqua nel tubo con gli ammortizzatori. La portata deve essere di circa 0,8 ml / min. </li><li> Premere annullare una volta sul controller perfusione per tornare al menu &quot;Select Function&quot;. Alterna l&#39;opzione &quot;Modifica Programmi&quot;, quindi digitare nel protocollo di perfusione indicato nella Tabella 1. Salvare il programma di perfusione. </li><li> Prendete le cellule fuori dell&#39;incubatore. Lavare due volte con il buffer di perfusione, e quindi impostare le celle sul palco. Collegare il sistema di perfusione alla camera. Se viene utilizzata una camera aperta, impostare un&#39;altra pompa che rimuove la soluzione di perfusione dalla camera. </li><li> Aprire il software Slidebook. Inizia una nuova diapositiva. Nota: L&#39;seguente procedura è specifica per software Slidebook, ma altri software come MetaFluor e Nis-elemento può essere utilizzato anche per il tipo di rappresentazione qui descritto. Teoricamente esperimenti possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi software che permette l&#39;imaging time-course, e le sequenze di immagini possono essere analizzati post-sperimentale utilizzando software come ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Tuttavia, il software che consente il monitoraggio in tempo reale di rapporto accettore / donatore è molto utile. </li><li> Montare il vetrino sul palco microscopio a fluorescenza. Trova le cellule co-esprimono il sensore e ASCT-mCherry utilizzando appositi set di filtri (vedi elenco dei materiali) con la funzione &quot;FOCUS&quot;. Regolare il guadagno facendo clic sulla scheda &quot;Camera&quot; e facendo scorrere la barra di scorrimento sotto &quot;guadagno&quot;. Inoltre, regolare l&#39;impostazione filtro a densità neutra dal menu a discesa filtro a densità neutra. Nota: Se il cubo del filtro non include un filtro occhio, non usare i pezzi oculari da Short-lunghezza d&#39;onda di luce di eccitazione è dannoso per gli occhi. Usare lo schermo del computer per individuare le celle invece. </li><li> Acquisire immagini di cellule with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (I filtri sono specificati nell&#39;Elenco dei materiali). Fare clic su &quot;Acquisizione Immagine&quot;, quindi nella finestra di acquisizione, specificare i filtri che stanno per essere utilizzati. Fare clic sul pulsante &quot;TEST&quot; per regolare il tempo di esposizione digitando il tempo di esposizione desiderato nella casella accanto alle impostazioni del filtro. Nota: Tutti e tre i canali devono essere esposti per la stessa lunghezza. Quando si regolano i parametri di imaging, prendere il cambiamento efficienza FRET previsto e piega aumentare in considerazione: per esempio, se l&#39;efficienza FRET si prevede di salire due volte durante l&#39;esperimento, i parametri di imaging devono essere regolatiin modo che l&#39;intensità di donatori ex Acceptor em Allo stato di riposo deve essere &lt;50% del valore massimo che può essere registrato dallo strumento, in modo che il canale non si saturi durante l&#39;esperimento. Segnale dalle cellule marcate dovrebbe essere almeno tre volte superiore a quello della regione di sfondo. </li><li> Prelievo di una regione di interesse utilizzando lo strumento regioni del software. In alternativa, una funzione software per selezionare i pixel sopra certa intensità può essere utilizzato, e quindi convertito in regioni. Per effettuare questa operazione, fare clic su Maschera - Segment, quindi spostare la barra di scorrimento per evidenziare le aree desiderate. </li><li> Selezionare &quot;time lapse&quot; nella casella Tipo di acquisizione, quindi specificare l&#39;intervallo (10 sec in questo esperimento) e punti di tempo per l&#39;esperimento. </li><li> Disegnare una regione in uno spazio senza alcuna cellule fluorescenti. Questa area è utilizzata per la sottrazione del fondo. Fare clic destro regione disegnata, e quindi impostare come sfondo. Nota: Idealmente, le cellule che non sonot esprimendo i sensori deve essere utilizzata come area di sfondo in considerazione sia la autofluorescenza e la fioritura sfondo rilevato dalla fotocamera. Se le suddette cellule sono disponibili nel campo visivo, almeno una regione senza le celle deve essere utilizzato per spiegare la fluorescenza di fondo. </li><li> Selezionare il programma desiderato sotto &quot;Select Function - Eseguire programmi&quot; l&#39;opzione. Alternare al programma memorizzato (vedere la fase 2.3), e poi ha colpito INVIO sul controller perfusione. Ora il programma viene caricato, e premendo un tasto qualsiasi inizierà la perfusione. </li><li> Garantire perfusione e l&#39;esperimento di imaging avviare Allo stesso tempo facendo clic sul pulsante &quot;Start&quot; nella finestra di acquisizione al tempo stesso come la pressione di un tasto sul controller perfusione. Nota: Si consiglia di registrare il tempo di valutazione in cui sono state scambiate le soluzioni (questo può essere fatto utilizzando funzione &quot;Note&quot;, che si trova all&#39;interno della scheda di acquisizione). </li><li> Eseguire la stessa perfusione protocollo USIng cellule esprimenti un sensore che dovrebbe essere saturi o non associati a condizione sperimentale. Nota: Qui, FLIPQTV3.0_1.5μ, che è saturo condizione sperimentale, viene usato come controllo, Figura 6 Tali esperimenti di controllo sono necessari per confermare che il cambiamento efficienza FRET è dovuta alla variazione effettiva del substrato e non. a causa del cambiamento di altri parametri quali pH cellulare. </li></ol> 3. Post-esperimento di analisi <ol><li> Esaminare se si è verificato deriva campione durante l&#39;esperimento. Disegnare regioni di interesse (ROI) s sull&#39;immagine scattata a timepoint 0, quindi spostare la barra di scorrimento nella parte superiore della finestra di imaging e verificare se le cellule cadono le ROI nelle immagini scattate nel corso della sperimentazione. </li><li> Se sì, allora utilizzare la funzione di tracking per correggere la deriva in primo luogo, la creazione di maschere intorno alle cellule selezionando Mask - Segment, quindi far scorrere la linea che specifica il taglio di HIGhlight le regioni contenente cellule. Traccia le regioni cliccando Mask - tracciamento di particelle - il monitoraggio di base delle particelle. </li><li> Ri-disegnare il ROI e lo sfondo regione quando necessario. </li><li> Esportare l&#39;intensità media dei ROI nel corso dell&#39;esperimento. Fare clic su Statistiche - Esporta - Dati Rapporto / timelapse. </li><li> Quando l&#39;efficienza FRET e la quantificazione della concentrazione del substrato non è necessario, tracciare l&#39;andamento temporale del rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) come proxy della dinamica del substrato. Per determinare la concentrazione citosolica, calcolare il massimo e minimo cambiamento rapporto (ossia alla saturazione e assenza del substrato, rispettivamente), Ar max - Ar min, mediante regressione non lineare di Δratio (Ar) con la seguente equazione: Ar = [S] / (K d + [S]) x (Ar <sub&gt; max - min Ar) + Ar min dove [S] è la concentrazione del substrato nel citosol. Utilizzando i Ar max - min valori Ar ottenuti, la saturazione (S) del sensore in un dato Ar è calcolato come S = (Ar - Ar min) / (Ar max - min Ar) S può inoltre essere convertito in concentrazione del substrato [S] con la seguente equazione: S = [S] / (K d + [S]) Nota: l&#39;intensità del canale em Acceptor ex Acceptor dovrebbe essere anche tracciato di esaminare se la condizione sperimentale influenzato la fluorescenza del accettore direttamente. </li><li> Quando si osserva una deriva della linea di base a causa di fotometabolismo, eseguire una correzione al basale. Per fare questo, tracciare le intensità di donatore e accettore nel tempo (Figura 5A). Poi identificare i punti temporali utilizzati per ªe basale, secondo il ritardo nel sistema di perfusione e l&#39;attività di trasporto del particolare cellula (Figura 5B). </li><li> Calcolare un raccordo polinomio che meglio descrive la linea di base. Poi, normalizzare l&#39;intensità grezzo da ogni tempo di valutazione al basale (Figura 5C). Calcolare il rapporto di intensità (Donor ex Acceptor em, / donatori ex donatori em) dalle intensità donatore e accettore normalizzati. </li></ol>

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Non c&#39;è nulla da rivelare.

Il successo di esperimenti di imaging dipende da alcuni fattori critici. Uno di questi fattori è l&#39;affinità di sensori utilizzati, come discusso sopra. Concentrazione assoluta del substrato nel compartimento subcellulare di interesse, tuttavia, è spesso sconosciuta. Pertanto si consiglia di provare diversi sensori con affinità sfalsati per trovare quello che funziona meglio sotto la condizione sperimentale desiderato. Ad esempio, nel nostro caso abbiamo trasfettato cellule COS7 con sensori di glutammina con 1.5?...

A causa di notevoli progressi nelle tecnologie che consente l&#39;esame del trascrittoma e proteoma a livello cellulare, ora è diventato chiaro che la biochimica e la conseguente flusso di metaboliti e ioni sono altamente tipo cellulare specifico. Ad esempio, nel fegato di mammiferi, degradazione glutammina sequenziale e sintesi vengono effettuate simultaneamente dalle cellule periportale e cellule perivenose rispettivamente, alimentando ammonio al ciclo dell&#39;urea nel primo tipo di cellula consumando eccesso di ammoniaca in quest&#39;ultimo 1-3. In alcuni casi, una significativa eterogeneità biochimica viene rilevato anche in un unico &quot;tipo cellulare&quot; 4, 5. Oltre a questa particolarità spaziale, i livelli cellulari di metaboliti e ioni sono altamente dinamici (per esempio, molecole di segnalazione come Ca 2 + e nucleotidi ciclici). I modelli spazio-temporali dei metaboliti e ioni giocano spesso un ruolo critico nella trasduzione del segnale. MONITORAGGIO dinamiche cellulari di metaboliti e ioni, tuttavia, pongono sfida unica. In molti casi la variazione delle concentrazioni sono rapido e transitorio, esemplificato dal caso di molecole di segnalazione come Ca 2 +, che decade entro ~ 20 msec in spine dendritiche 6. Inoltre, compartimentazione di vie biochimiche all&#39;interno e tra le cellule rende difficile quantificare le dinamiche di metaboliti e ioni con estrazione e cromatografia su colonna / tecniche di spettrometria di massa. Sensori geneticamente codificate molecole biologiche sono ora ampiamente utilizzati a causa della alta risoluzione spazio-temporale che permette lo sperimentatore di studiare dinamica molecolare di breve durata e / o compartimenti (recensiti 7, 8). Questi sensori geneticamente codificati possono grossolanamente essere suddivisi in due categorie; sensori basati sull&#39;intensità e sensori ratiometic. Sensori basati intensità, in genere costituiti da un dominio di legame e l&#39;influenzaproteina orescent (PQ), e il legame al dominio di legame soluto cambia l&#39;intensità fluorescente. Sensori Ratiometic, d&#39;altra parte, spesso sfruttano Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra due PQ che fungono da coppia FRET. Questi sensori sono costituiti da un dominio di legame e due PQ, e il legame soluto induce la variazione di efficienza FRET tra i due PQ. Un gran numero di sensori per biologicamente importanti metaboliti e ioni sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni 8, 9. Una delle eccitante possibilità offerta da tali sensori geneticamente codificati è il loro uso nell&#39;analisi ad alta risoluzione di processi di trasporto di membrana, che in precedenza non era facile individuare a livello cellulare. Sensori geneticamente codificati facilitano l&#39;analisi dei meccanismi di trasporto come specificità di substrato e pH dipendenza 10, 11. Inoltre, in combinazione con i res geneticheONTI come la biblioteca di RNAi costruisce per organismi modello, è ora possibile effettuare ricerche genome-wide per i processi di trasporto innovativi che utilizzano sensori geneticamente codificati. Infatti, l&#39;uso di organismi geneticamente codificato cavo del sensore alla scoperta dei trasportatori in precedenza non caratterizzate in più casi 12, 13. Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato una serie di sensori basati su FRET per la glutammina. Abbiamo dimostrato che i livelli di glutammina cellulare può essere osservata con tali sensori FRET glutammina 10. Questi sensori sono costituiti da un donatore FRET (mTFP1) inserito in un batterica proteina legante glutammina glnH, e un accettore FRET (venus) al C-terminali di glnH (Figura 1). FRET efficienza di questi sensori diminuire in seguito al legame di glutammina, con conseguente diminuzione del rapporto di intensità accettore / donatore. Belle regolazione dei processi di trasporto glutammina è importante nei processi biologici quali neurotransmissione 14, 15 e la manutenzione di ciclo dell&#39;urea nel fegato 1, 16, 17. Qui vi mostriamo la metodologia di analisi delle attività di trasporto con sensori FRET per la glutammina, con un ampio campo di microscopio a fluorescenza set-up. Lo scopo degli esperimenti mostrato qui di rilevare attività trasportatore in una singola cella ed esaminare specificità di substrato di un trasportatore transitoriamente espressa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81F-3-5</td>
			<td>An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (mTFP1)</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>3RD450-460</td>
			<td>band width 450-460 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exitation filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500/20</td>
			<td>band width 490-510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (mTFP1)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>HQ495/30m</td>
			<td>band width 475-505nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission filter (Venus)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET535/30m</td>
			<td>band width 520-550nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (FRET channels)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>470dcxr</td>
			<td>long pass, 470nm cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror (YFP channel)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>89002bs</td>
			<td>passes 445-490nm, 510-560nm, 590-680nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49008</td>
			<td>excitation 540-580nm, long pass dichroic with 585nm cut off, emission filter 595-695nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-LH100L-3-5</td>
			<td>LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>Rolera-MGi EMCCD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apochromatic fluorescence objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system, ValveBank II</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>[01-08]</td>
			<td>Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow chambers</td>
			<td>C&#38;L Instruments</td>
			<td>VC-MPC-TW</td>
			<td>Other larminar-flow chambers would also work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered slide</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion pump</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74-046-12131</td>
			<td>For open-chamber experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software supporting ratiometric measurements</td>
			<td>Intellegenent Imaging Innovation</td>
			<td>Slidebook 5.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA-3A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-255-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s MEM (DMEM)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmic Calf Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH3008703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Used with Lipofectamine 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine solution</td>
			<td>sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm circular glass cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>in case VC-MPC-TW is used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Other transfection reagents can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A (Hank&#39;s buffer)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>9.7g HANK salt (Sigma H1387), 0.35g NaHCO3, 5.96g HEPES to 1L, pH adjusted to 7.35 with NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.04mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 0.2mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 1mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Gln</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solution A + 5mM Ala</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glutamine flux imaging using genetically encoded sensors

I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Una enorme varietà di tali sensori per molecole biologiche si sono resi disponibili negli ultimi 15 anni, alcuni dei quali divenne strumenti indispensabili che vengono utilizzati di routine in molti laboratori. Una delle interessanti applicazioni di sensori geneticamente codificati è l&#39;uso di questi sensori nelle indagini processi di trasporto cellulari. Proprietà dei trasportatori come cinetica e specificità di substrato possono essere studiati a livello cellulare, fornendo possibilità di cellula di tipo analisi specifiche delle attività di trasporto. In questo articolo, vedremo dimostrare come la dinamica dei trasportatori possono essere osservate con sensore di glutammina geneticamente codificato come un esempio. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi.

Tipici esperimenti time-corso sono rappresentati in Figura 2. In questi esperimenti, FRET sensori di glutammina con affinità di 8 mm (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 micron (μ FlipQTV3.0_100 C e D) sono stati co-espressi con un obbligatorio scambiatore amminoacido ASCT2 18 in cellule COS7 10. Afflusso di glutammina viene rilevato come variazione rapporti di intensità di fluorescenza tra il donatore (mTFP1) e l&#39;accettore (venus) ...

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Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.

La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Virginia Tech.  In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati. 

Video: Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Ricerca

Bioingegneria

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

Flying Insect Detection and Classification with Inexpensive Sensors

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow for the development of many useful applications in vector and pest control for both medical and agricultural entomology. Given this, the last sixty years have seen many research efforts devoted to this task. To date, however, none of this research has had a lasting impact. In this work, we show that pseudo-acoustic optical sensors can produce superior data; that additional features, both intrinsic and extrinsic to the insect&#8217;s flight behavior, can be exploited to improve insect classification; that a Bayesian classification approach allows to efficiently learn classification models that are very robust to over-fitting, and a general classification framework allows to easily incorporate arbitrary number of features. We demonstrate the findings with large-scale experiments that dwarf all previous works combined, as measured by the number of insects and the number of species considered.

We proposed a system that uses inexpensive, noninvasive pseudo-acoustic optical sensors to automatically and accurately detect, count, and classify flying insects based on their flying sound.

Volare Insetto rilevamento e classificazione con sensori Economico

An inexpensive, noninvasive system that could accurately classify flying insects would have important implications for entomological research, and allow ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gene Transfection verso Celle sferoide su lastre micropatterned coltura per trapianto di cellule geneticamente modificati

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selective cellulare eliminazione dalla misto Cultura 3D utilizzando una tecnica Near Infrared Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. The introduced genetic material may integrate into the embryonic genome and generate transgenic animals with foreign genetic information following transfer of the injected embryos to foster mothers. Following the success in mice, PN injection has been applied successfully in many other animal species. Recently, PN injection has been successfully employed to introduce reagents with gene-modifying activities, such as the CRISPR/Cas9 system, to achieve site-specific genetic modifications in several laboratory and farm animal species. In addition to mastering the special set of microinjection skills to produce genetically modified animals by PN injection, researchers must understand the reproduction physiology and behavior of the target species, because each species presents unique challenges. For example, golden Syrian hamster embryos have unique handling requirements in vitro such that PN injection techniques were not possible in this species until recent breakthroughs by our group. With our species-modified PN injection protocol, we have succeeded in producing several gene knockout (KO) and knockin (KI) hamsters, which have been used successfully to model human diseases. Here we describe the PN injection procedure for delivering the CRISPR/Cas9 complex to the zygotes of the hamster, the embryo handling conditions, embryo transfer procedures, and husbandry required to produce genetically modified hamsters.

Pronuclear (PN) injection of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) system is a highly efficient method for producing genetically engineered golden Syrian hamsters. Herein, we describe the detailed PN injection protocol for the production of gene knockout hamsters with the CRISPR/Cas9 system.

Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Tratti della fibra di un neurone di targeting per la terapia di stimolazione cerebrale profonda utilizzando modelli interattivi, specifico per ogni paziente

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...