Name: Video: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00
Duration: 10 min
Description: 15.3K Views. University of California Davis. Dimostriamo la realizzazione di un basso costo stadio criogenico progettato per adattarsi microscopi a luce riflessa più. Questo laboratorio costruito fase criogenica consente efficiente e affidabile di imaging correlativa tra crio-crio-luce e microscopia elettronica.

Gli autori desiderano ringraziare Brandon J. Zipp e Ken B. Kaplan per fornire accesso al ceppo di lievito utilizzato in questo studio. Gli autori hanno anche ringraziare Julio Lenin Dominguez-Ramirez per l&#39;assistenza con videoregistrazione. JEE NIH riconosce un sostegno finanziario dal codice di autorizzazione 5RC1GM91755.

1. Fabbricazione e montaggio <ol><li> Collocare il dissipatore di calore in alluminio all&#39;interno del 22,96 centimetri (9 &quot;) pan torta di circa 2 cm dal lato della vaschetta, come mostrato nella Figura 1c Usando una penna nera pennarello, segnare i fori per il dissipatore di calore in alluminio Note:.. Se l&#39;alluminio blocco (acquistato in un negozio locale rottami metallici o online all&#39;indirizzo <a href="http://www.onlinemetals.com">http://www.onlinemetals.com</a> ) non sono dotati di fori predisposti, è necessario organizzare per avere fori e svasati prima del passaggio 1 per assicurare l&#39;alluminio blocco nella padella torta. Abbiamo usato 5 fori per fissare il blocco alla piattaforma e 4 fori supplementari per permettere bolle di gas di azoto per sfuggire da sotto il alluminio. </li><li> Posizionare la griglia di crio-box vicino alla posizione del dissipatore di calore in alluminio e segnare la tacca e ogni lato. </li><li> Praticare dei fori pilota per ogni posizione contrassegnata con un po &#39;# 17 trapano per i fori in alluminio dissipatore di calore e un po&#39; # 35 trapano per la crio-griglia di fori box. </li><li> Montare il dissipatore in alluminio con 5 - # 10, 1,9 centimetri (3 / 4 &quot;) a testa piana con intaglio bulloni e dadi corrispondente così come 15 - # 10 rondelle Inserire due rondelle sotto il blocco di alluminio e il terzo sul retro del. torta di pan per ciascun foro. Nota: sbalzi chirografari del blocco di alluminio presso l&#39;area di visualizzazione può risultare in vibrazioni che limitano le capacità di imaging del palcoscenico Verificare che tutti i bulloni di fissaggio siano ben serrati.. </li><li> Inserire 3 - # 4, 0,95 centimetri (3 / 8 &quot;) rotondo scanalato bulloni e dadi corrispondente dalla parte posteriore della torta di pan di agire come la finestra di montaggio crio-griglia. </li><li> Nastro 4 bacchette insieme a coppie con una bacchetta sopra l&#39;altro. Nastro ogni coppia di spigoli opposti della tortiera di agire come distanziatori. </li><li> Bagnare la superficie superiore e inferiore della torta e torta di pentole, rispettivamente con DDH 2 O. </li><li> Riempire la tortiera con due strati di schiuma isolante spray. Bagnare ogni strato prima di passare alla fase successiva. </li><li> Premere il pan torta nella schiuma. </li><li> Capovolgere le pentole a testa in giù e premere sul tortiera fino a quando i distanziatori contattare la padella torta. Collocare alcun oggetto ponderata in cima alla tortiera e lasciate riposare durante la notte per curare. </li><li> Con un coltello seghettato, tagliare via l&#39;eccesso essiccato isolante in schiuma spray dal bordo delle pentole e rimuovere le bacchette. </li><li> Togliere la tortiera dal tegame torta. La pentola a torta con dissipatore di calore in alluminio è ora isolato e sarà denominato &quot;stadio criogenico&quot; (Fig. 1a). </li><li> Inserire una Appunti di plastica trasparente (di qualsiasi colore e superiore a 3 mm di spessore) sopra la parte superiore del palco criogenico. Segnare con un pennarello nero la posizione del crio-grid montare box disegnando un cerchio di circa 1,5 volte il diametro di un singolo round crio-grid box. Tagliare foro con un 1,9 centimetri (3 / 4 &quot;) sega a tazza. Appunti Questa sarà denominato&quot; schermata di caricamento &quot;(Figura 1b). </li><li> Mettere un nuovo appunti trasparente in cima alla fase criogenici e posto sul microscopio con il dissipatore di calore direttamente sotto le lenti dell&#39;obiettivo. Con un pennarello nero, segnano il cammino degli obiettivi mentre ruotano. </li><li> Tagliare lungo la linea segnata la rimozione di un mezzo cerchio dal bordo degli appunti. Questo può essere realizzato con un seghetto o con un 7,62 cm (3 &quot;) buco visto più volte come mostrato nel video. </li><li> Infine tagliare un 1,9 centimetri (3 / 4 &quot;) buco di distanza dal mezzo cerchio, ma ancora all&#39;interno dell&#39;area del piatto. Questa sarà la porta per il riempimento di azoto liquido (LN 2) se i livelli di caduta, mentre l&#39;imaging. Questi appunti si farà riferimento come la &quot;schermata di visualizzazione&quot; (Fig. 1c). </li></ol> 2. Preparazione del campione <ol><li> Diluire log cellule di lievito coltivate in fase di sintesi completa (SC) i media a un&#39;adeguata concentrazione di 1x10 6 cellule / ml in acqua. </li><li> 2 mL del lievito diluito vengono aggiunti su una R2 / 1 400 mesh bucata carbonio rivestito in rame Cryo-EM griglia (Forniture SPI, West Chester, PA) e ha permesso di assorbire per 15 secondi. </li><li> Blot via il liquido in eccesso dalla superficie della griglia toccando il fondo della griglia per un pezzo di tessuto strappato cellulosa molli (Kimwipe) per 2 secondi. </li><li> Se necessario, la griglia può essere lavato con 3 ml di gocce d&#39;acqua (1-3 volte), e malvagio via come al punto 3 tamponando dal retro. </li><li> Prima del lavaggio finale, il campione viene caricato nel congelatore tuffo pneumatico e la griglia impiccagione viene lavato come al punto 2.4. Dopo blotting la griglia con carta velina strappata (Kimwipe) per rimuovere la maggior parte dell&#39;acqua dalla superficie, la griglia è immerso in LN 2 etano liquido raffreddato e trasferito in una griglia di crio-box per stoccaggio Nota 1:. È importante lasciare uno strato di liquido più sottile possibile in superficie per mantenere il campione idratata. Impropri blotting si sia asciugare il campione o lasciare ghiaccio che è opaco il fascio di elettroni. </li></ol> 3. Cryo-Light Microscopia <ol><li> Riempire lo stadio criogenico conlN 2 e subito coprire con la schermata di caricamento (appunti di plastica con solo 1,9 centimetri (3 / 4 &quot;) buco). </li><li> Una volta che il metallo raggiunge lN 2 temperatura, trasferire la crio-box attraverso la griglia di 1,9 centimetri (3 / 4 &quot;) buco della schermata di caricamento e il trasferimento in supporto creato dal 3 viti descritto nella parte A5. Svitare la griglia di crio-box dal supporto e rimuovere il supporto per un migliore accesso. Conservare la crio-griglia titolare casella sotto lN 2 in un dewar separati fino passo 3.10. La griglia di crio-box devono essere tenuti sotto lN 2 a prevenire griglia di riscaldamento del campione. </li><li> . Ricarica lN 2 nella fase criogenico a poco sotto la parte superiore del dissipatore di calore in alluminio Note: lN 2 livelli devono essere periodicamente controllato e riempito durante il processo di imaging per assicurare lN 2 è continuamente in contatto con il dissipatore di calore. In generale, la ricarica avviene ogni 10 minuti attraverso la porta di riempire lo schermo. </li><li> Pre-raffreddare la pinzetta a punta lN 2, quindi trasferire il reticolo (s) sulla superficie piatta visione del dissipatore di calore in alluminio con le pinzette, utilizzando il 1,9 centimetri (3 / 4 &quot;) buco della schermata di caricamento. </li><li> Muovere con cautela il crio-palco per aperture sotto l&#39;obiettivo del microscopio a luce riflessa è. </li><li> Posizionare lo schermo trasparente visione in cima alla schermata di caricamento. Poi lentamente togliere la schermata di caricamento facendolo scorrere sotto la visualizzazione sullo schermo. Nota: A questo punto, il campione è più vulnerabile. Tutte le correnti d&#39;aria intorno al microscopio deve essere minimizzata, tra cui: la respirazione, una porta vicino, gente che cammina passato, ecc Consigliamo indossa una maschera o appendere uno schermo trasparente volto sotto il microscopio oculari come misura precauzionale. </li><li> Ruotare le lenti obiettivo nell&#39;ambiente freddo gas di azoto del crio-stage e scansione per il campione in piano area di visualizzazione dissipatore di calore. Utilizzando le normali brillante luce le tecniche di microscopia campo concentrarsi sulla griglia di partenza con un obiettivo a basso ingrandimento per trovare il centro e scattare una foto panoramica. Specifiche per quanto riguarda le lenti microscopia ottica utilizzata per questo esperimento sono elencati nella sezione Sperimentale Materiali. Nota: LN 2 non entrare in contatto con le lenti obiettivo e dobbiamo ancora vedere il degrado di immagini o danneggiamento delle lenti dagli effetti del raffreddamento . </li><li> Focus in alto ingrandimento su un&#39;area di interesse e di acquisire dati con campo chiaro, campo scuro, luce polarizzata o di imaging di fluorescenza. Assicurarsi di registrare la posizione della zona di interesse sui bassi ingrandimenti dell&#39;immagine campo luminoso futuro per la correlazione. Se tutte le precauzioni indicate per il riempimento della lN 2 sono seguiti, poi la pressione positiva l&#39;azoto evapora è sufficiente per mantenere un ambiente privo di contaminazione (indipendente di umidità ambiente) per la durata di imaging. </li><li> Una volta terminato, sostituire la schermata di caricamento facendolo scorrere sopra la parte superiore dello schermo. Rimuovere la schermata di visualizzazione rallentando scorrere sotto la schermata di caricamento. </li><li> Rimuovere la fase di crio dal microscopio e con pre-raffreddata pinzette, trasferire la griglia posteriore al crio-griglia box. Avvitare il crio-griglia titolare box in crio-grid box per sigillare contro l&#39;ambiente e trasferire il supporto a un dewar LN2 per lo stoccaggio e l&#39;imaging futuro. </li></ol> 4. Cryo-Microscopia Elettronica <ol><li> A seguito di tecniche standard e stabilito, caricare la griglia di campione in una Cryo-EM titolare trasferimento mantenendo il provino alla temperatura dell&#39;azoto liquido in ogni momento. </li><li> Inserire il crio-titolare con griglia campione in un microscopio elettronico a trasmissione. </li><li> In una visione adatta a basso ingrandimento (50-500x ingrandimento nominale), trovare il centro della griglia campione. </li><li> Utilizzare i raccolti in precedenza a basso ingrandimento crio-LM dati a partire dal punto 3,7 a determinare l&#39;orientamento relativo di linguette di rame centrale della griglia (come descritto nella Figura 2) e identificare le aree di interesse per l&#39;esatta correlazione. </li><li> Procedere con l&#39;allineamento microscopio, a basso dosaggio Cryo-EM imaging e raccolta dei dati. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Lo stadio criogenico (Fig. 1a) è un modo efficace per raccogliere crio-LM dati per crio-microscopio a fluorescenza e analisi cryo-LM/cryo-EM correlativo. La figura 2 mostra come la combinazione di bassa e alta ingrandimento crio-LM immagini consente di creare mappe di riferimento che indirizzarvi verso aree specifiche in Cryo-EM. La risultante crio-LM mappa di riferimento (Fig 2b) è stato utilizzato durante la Cryo-EM di acquisizione dati per individuare le regioni esatto mostrato nella Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Stadio criogenico. A) Il layout dello stadio criogenico costituito da una griglia di trasferimento di crio-box montare indicato won una freccia bianca ed un dissipatore di calore in alluminio. Le griglie sono trasferiti sotto lN 2 dalla crio-griglia di box e posti direttamente sul dell&#39;area di visualizzazione del dissipatore di calore come indicato dalla freccia nera. B) immagine raffigurante lo stadio criogenico con caricamento schermo. Il buco nella schermata di caricamento sia posizionata direttamente sopra la casella di montaggio crio-grid e funge da porta per il trasferimento dei campioni e per la movimentazione dei campioni da crio-griglia casella per l&#39;area campione visualizzazione sul dissipatore di calore con una pinzetta. C) Il criogenico fase in posizione sotto le lenti dell&#39;obiettivo con lo schermo di visualizzazione in posizione. Il ritaglio speciale sullo schermo permette la visualizzazione delle lenti obiettivo di oscillare facilmente in posizione senza spostare lo stadio criogenico. Il foro nella schermata di visualizzazione di distanza dalla zona del campione funge da LN 2 riempire porta per ricostituire lN 2 livelli, se necessario. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Navigare in crio-LM per gli studi correlativi. A) a basso ingrandimento crio-LM vista di cellule di lievito aderito a una griglia di esempio. B) La stessa immagine in (a) sovrapposti con una immagine forte ingrandimento fluorescenza di una zona di interesse e con un poligono pieno arancione che segna il centro della griglia campione. Il centro è costituito da un gruppo di quattro piazze, tre hanno una scheda aggiuntiva in metallo e il quarto aperto. Per le tre piazze con la linguetta di metallo in più, due coppie di condividere la scheda sulle assi lungo e corto formando un centro asimmetrico. Questo centro asimmetrico può essere visto in alto a sinistra ed è stato usato per indicare l&#39;angolo di rotazione e la prepotenza della griglia tra crio-LM e Cryo-EM. Da una zone basse immagine ingrandimento molti di interesse possono essere contrassegnati ed usato come una mappa di riferimento per individuare le aree identiche a Cryo-EM. C) Un ingrandita fluorescenza crio-LM immagine dell&#39;area di interesse (b). HTA1-PCP, un C-terminale marcatore CFP istoni, può essere visto come una struttura verde punteggiata di etichettatura la posizione del nucleo. D) Un Cryo-EM immagine dell&#39;area corrispondente (c). Scala bar rappresentano 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/2909/2909fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Correlazione di crio-LM e Cryo-EM. Due campi di vista che rappresentano cellule di lievito identico correlata con crio-brillante campo (a, d), crio-fluorescenza (b, e), e di Cryo-EM (c, f ). scala barre rappresentano il 5 micron.

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	<li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments.">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li><li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography:+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes.">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li><li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images.">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li><li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li><li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li><li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy.">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non conflitto di interessi finanziari.

<p class="jove_content"&gt; Utilizzando il nostro stadio criogenico e le tecniche di preparazione del campione, gli studi correlativo tra crio-LM e Cryo-EM mostra diversi vantaggi rispetto ai tradizionali approcci temperatura ambiente compreso, ma non limitato a: fissaggio rapido<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Ridotto photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt;, E la scansione di integrità del campione prima di Cryo-EM<sup&gt; 4,5</sup&gt; O chimiche fissazione / embedding<sup&gt; 6</sup&gt;. Uno dei colli di bottiglia per Cryo-EM la raccolta dei dati è il tempo necessario sia per il trasferimento del campione in un TEM e la scansione della rete per trovare le regioni adatta all&#39;immagine. Con la rapida acquisizione crio-LM dati<sup&gt; 5</sup&gt;, Il tempo dedicato trovare le cellule buone possono essere notevolmente ridotti. Quindi, possiamo risparmiare tempo e denaro e ridurre questo collo di bottiglia da pre-scansione e la mappatura delle aree di interesse crio-LM.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Fasi più costosi o complessi criogeniche possono permettere una risoluzione maggiore crio-LM imaging. Tuttavia, la fase di fabbricato qui è più che sufficiente per molte applicazioni. Se crio-LM imaging e trasferimenti griglia del campione vengono eseguite con cautela, come descritto nel testo e video, completamente le immagini contaminazione libera può essere realizzato. Questo metodo permette correlazione diretta dei dati di microscopia a fluorescenza ed elettronica della cellula stessa, organello o complesso macromolecolare dispersi sul supporto di carbonio o contenuto all&#39;interno di una sezione di tessuto sottile<sup&gt; 7</sup&gt;. Va notato che il valore di questo stadio criogenico si estende oltre cryo-LM/cryo-EM studi correlativo al campo della microscopia ottica nel suo complesso. Questo stadio criogenico è adatto per entrambi i campioni delicati e coloranti fluoroforo / macchie<sup&gt; 8</sup&gt;, Quantum Dots, o proteine ​​fluorescenti tag<sup&gt; 9</sup&gt; Che può essere instabile durante la fissazione chimica temperatura ambiente e integrazione con paraformaldeide e glutaraldeide. Come risultato, ci auguriamo che questa fase criogenica fornirà un maggiore accesso a chi è interessato a crio-LM, che sono stati precedentemente scoraggiare l&#39;accesso dei costi e insufficiente.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Risoluzione dei problemi Cryo-Light Microscopia</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. Esempio di adsorbimento:</em&gt; Campioni diversi possono presentare caratteristiche di assorbimento variabile al supporto di carbonio. Si può essere necessario utilizzare altri tipi di griglie di supporto come il carbonio continuo, carbonio bucata, o formvar griglie rivestito per il supporto del campione. Inoltre, se il campione è vincolante per le barre di rame della rete e non la superficie in carbonio, potrebbe essere necessario regolare la chimica di superficie di carbonio incubando la griglia con un agente umettante o bagliore scarico prima dell&#39;aggiunta del campione.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. Fase di stabilità:</em&gt; Se si notano delle vibrazioni, è probabilmente dovuto alla fase campione in sovraccarico di peso, piuttosto che il gorgogliare di LN2. Il peso aggiunto della fase criogenica, a volte può causare vibrazioni a bassa frequenza per trasmettere lungo lo standard a 3 assi fase di apertura microscopio, e incidono negativamente immagini tramite la sfocatura. Questo può essere facilmente corretto sostenendo fase di apertura del microscopio da sotto sia con un mini-regolabile ascensore o un adattatore regolabile con doppia vite di armi, come mostrato nel video. Entrambi questi meccanismi di sostegno regolabile interagire con un non-mobile porzione di palco di viaggio e quindi consenta ancora X e Y traduzione secondo quanto richiesto per l&#39;imaging.</p

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Catalogo </th><th> Commenti </th><th> Costo </th></tr><tr><td> 1-22,86 cm (9 &quot;) pan a torta con bordi inclinati </td><td> Cuocere bene </td><td></td><td> Drogheria locale </td><td> 4,39 dollari </td></tr><tr><td> 1-22,86 cm (9 &quot;) tortiera </td><td> Cuocere bene </td><td></td><td> Drogheria locale </td><td> 4,93 dollari </td></tr><tr><td> 4 paia di bacchette </td><td></td><td></td><td> Drogheria locale </td><td> 0,50 dollari </td></tr><tr><td> 1 - Grande schiuma spray Stuff </td><td> Roba grande </td><td></td><td> Ferramenta locale </td><td> 5,98 dollari </td></tr><tr><td> 1 - 4 centimetri x8cm x1cm blocco di alluminio </td><td></td><td></td><td> Ferramenta locale o rottami metallici cantiere </td><td> 10,00 $ </td></tr><tr><td> 5 - # 10 1,91 centimetri (3 / 4 &quot;) a testa piana con intaglio Bulloni w / dadi </td><td></td><td></td><td> Ferramenta locale </td><td> 0,98 dollari </td></tr><tr><td> 3 - # 4 0,95 centimetri (3 / 8 &quot;), l&#39;intaglio bulloni w / dadi </td><td></td><td></td><td> Ferramenta locale </td><td> 0,98 dollari </td></tr><tr><td> 15 - # 10 rondelle </td><td></td><td></td><td> Ferramenta locale </td><td> 0,98 dollari </td></tr><tr><td> 2 - appunti di plastica trasparente </td><td></td><td></td><td> Ufficio negozio locale </td><td> 6,84 dollari </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM casella della griglia titolare </td><td> Ted Pella </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - Cryo-EM casella della griglia asta di movimentazione </td><td> Ted Pella </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 - R2 / 1 film di carbonio bucata, 400-rete in rame Cryo-EM griglia di supporto </td><td> SPI Forniture </td><td> 4340C-XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Materiali sperimentali <ol><li> Ceppo di lievito: Hta1-PCP:: Kan (KSC-3382: Mata, ura3-52, lys2-801, ade2-101, TRP1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP:: KanMX6 dal laboratorio Kaplan presso la UC Davis). </li><li> Cryo-Light Microscopy: Cryo-luce immagini di microscopia sono state scattate in un microscopio Leica DM4000M riflettendo con una Leica DFC310 FX CCD. Campo chiaro, campo scuro e le immagini di fluorescenza sono state acquisite utilizzando un HCX PL FLUOTAR 5x 0,15 NA obiettivo aria, un HCX PL FLUOTAR 10x 0,30 NA obiettivo aria, un PL FLUOTAR 50x 0,55 NA obiettivo di aria o di un NPLAN 100x 0,75 NA obiettivo aria. Campo luminoso e campo scuro immagini utilizzate una lampada da 12V 100W tungsteno come sorgente luminosa. Per fluorescenza, una fonte EL6000 lampada UV è stata utilizzata in combinazione con un JC1 Leica (Ex.F.: BP 480/30, DM: LP 505, SF BP 535/40 e LP 580) Cubo filtro. </li><li> Cryo-microscopia elettronica a trasmissione: Cryo-EM immagini sono state acquisite su un JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Giappone) che operano a 200 KeV utilizzando un Gatan 626 crio-transfer titolare (Gatan, USA). Micrografie sono state registrate ad ingrandimenti nominale di X 50, 200, 1.200 e 4.000 su 4.096 x 4.096 pixel Tietz CCD (TVIPS, Gauting, Germania). </li></ol>

low-cost cryo-light microscopy stage fabrication for correlated light/electron microscopy

L&#39;accoppiamento di crio-microscopio luce (crio-LM) e crio-microscopia elettronica (cryo-EM) pone una serie di vantaggi per comprendere le dinamiche cellulari e ultrastruttura. In primo luogo, le cellule possono essere esposte in un ambiente vicino nativo per entrambe le tecniche. In secondo luogo, a causa del processo di vetrificazione, i campioni sono conservati da una rapida immobilizzazione fisica piuttosto che la fissazione chimica lenta. In terzo luogo, l&#39;imaging lo stesso campione sia con crio-LM e Cryo-EM offre la correlazione di dati provenienti da una singola cellula, piuttosto che un confronto tra &quot;campioni rappresentativi&quot;. Mentre questi benefici sono ben noti da studi precedenti, l&#39;uso diffuso di correlativo crio-LM e Cryo-EM rimane limitata a causa delle spese e la complessità di acquisto o costruzione di un palcoscenico adatto criogenico microscopia ottica. Qui mostriamo il montaggio e l&#39;uso di una fase economica criogenico che possono essere fabbricate in ogni laboratorio per meno di $ 40 con parti disponibili all&#39;indirizzo ferramenta e negozi di alimentari. Questo crio-LM stadio è stato progettato per l&#39;utilizzo con microscopi luce riflessa che sono dotati di obiettivi a lunga distanza di lavoro aria. Per correlativo crio-LM e Cryo-EM studi, adattiamo l&#39;uso di carbonio rivestito standard 3 mm Cryo-EM griglie come supporti campione. Dopo adsorbente il campione alla rete, i protocolli precedentemente stabilito per vetrificanti il ​​campione e il trasferimento / gestione della rete sono seguite per permettere a più tecnica di imaging. Come risultato, questa configurazione consente a qualsiasi laboratorio con un microscopio a luce riflessa di avere accesso a immagini correlativo diretto di campioni congelati idratata.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Dimostriamo la realizzazione di un basso costo stadio criogenico progettato per adattarsi microscopi a luce riflessa più. Questo laboratorio costruito fase criogenica consente efficiente e affidabile di imaging correlativa tra crio-crio-luce e microscopia elettronica.

Low-Cost Cryo-Stage Light fabbricazione microscopia per Luce correlate / Microscopia Elettronica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

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Video: Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical sectioning of complex systems. Confocal microscopy is routinely used, for example, to study specific cellular targets1, monitor dynamics in living cells2-4, and visualize the three dimensional evolution of entire organisms5,6. Extensions of confocal imaging systems, such as confocal microendoscopes, allow for high-resolution imaging in vivo7 and are currently being applied to disease imaging and diagnosis in clinical settings8,9.
Confocal microscopy provides three-dimensional resolution by creating so-called "optical sections" using straightforward geometrical optics. In a standard wide-field microscope, fluorescence generated from a sample is collected by an objective lens and relayed directly to a detector. While acceptable for imaging thin samples, thick samples become blurred by fluorescence generated above and below the objective focal plane. In contrast, confocal microscopy enables virtual, optical sectioning of samples, rejecting out-of-focus light to build high resolution three-dimensional representations of samples.
Confocal microscopes achieve this feat by using a confocal aperture in the detection beam path. The fluorescence collected from a sample by the objective is relayed back through the scanning mirrors and through the primary dichroic mirror, a mirror carefully selected to reflect shorter wavelengths such as the laser excitation beam while passing the longer, Stokes-shifted fluorescence emission. This long-wavelength fluorescence signal is then passed to a pair of lenses on either side of a pinhole that is positioned at a plane exactly conjugate with the focal plane of the objective lens. Photons collected from the focal volume of the object are collimated by the objective lens and are focused by the confocal lenses through the pinhole. Fluorescence generated above or below the focal plane will therefore not be collimated properly, and will not pass through the confocal pinhole1, creating an optical section in which only light from the microscope focus is visible. (Fig 1). Thus the pinhole effectively acts as a virtual aperture in the focal plane, confining the detected emission to only one limited spatial location.
Modern commercial confocal microscopes offer users fully automated operation, making formerly complex imaging procedures relatively straightforward and accessible. Despite the flexibility and power of these systems, commercial confocal microscopes are not well suited for all confocal imaging tasks, such as many in vivo imaging applications. Without the ability to create customized imaging systems to meet their needs, important experiments can remain out of reach to many scientists.
In this article, we provide a step-by-step method for the complete construction of a custom, video-rate confocal imaging system from basic components. The upright microscope will be constructed using a resonant galvanometric mirror to provide the fast scanning axis, while a standard speed resonant galvanometric mirror will scan the slow axis. To create a precise scanned beam in the objective lens focus, these mirrors will be positioned at the so-called telecentric planes using four relay lenses. Confocal detection will be accomplished using a standard, off-the-shelf photomultiplier tube (PMT), and the images will be captured and displayed using a Matrox framegrabber card and the included software.

The complete construction of a custom, real-time confocal scanning imaging system is described. This system, which can be readily used for video-rate microscopy and microendoscopy, allows for an array of imaging geometries and applications not accessible using standard commercial confocal systems, at a fraction of the cost.

Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

Confocal microscopy has become an invaluable tool in biology and the biomedical sciences, enabling rapid, high-sensitivity, and high-resolution optical ...

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Bioingegneria

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

High Throughput Microfluidic rapido ed economico prototipazione metodi a basso Packaging

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using traditional liquid injection molding processes can be an expensive process due to tooling and equipment costs. As a result, it has traditionally been impractical to use liquid injection molding for low-cost, rapid prototyping applications. We have devised a method for rapid and low-cost production of liquid elastomer injection molded devices that utilizes fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as an injection system. Low costs and rapid turnaround time in this technique lower the barrier to iteratively designing and prototyping complex elastomer devices. Furthermore, CAD models developed in this process can be later adapted for metal mold tooling design, enabling an easy transition to a traditional injection molding process. We have used this technique to manufacture intravaginal probes involving complex geometries, as well as overmolding over metal parts, using tools commonly available within an academic research laboratory. However, this technique can be easily adapted to create liquid injection molded devices for many other applications.

We have devised a method for low-cost and rapid prototyping of liquid elastomer rubber injection molded devices by using fused deposition modeling 3D printers for mold design and a modified desiccator as a liquid injection system.

Rapida e basso costo Prototipazione di dispositivi medici che usano 3D Stampo Stampato per stampaggio ad iniezione Liquid

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all&#39;interno di liposomi come strumento per<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Progettazione di una stampante 3D Open-Source, a basso costo per l'estrusione di bioink e di fusione alimentare

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...