Questo studio è stato supportato dal NIHM concedere MH091816 R01 e R21 MH084043 di TDG.

1. Materiali e metodi 1.1. Il serbatoi d&#39;acqua I serbatoi cilindrici (30 cm di altezza x 20 diametro cm) necessari per il test del nuoto forzato (FST) nel nostro laboratorio sono realizzati in plexiglas trasparente, in quanto questo materiale è in grado di resistere alle frequenti spostamenti dei carri armati e gli incidenti meglio di vetro. Il livello dell&#39;acqua è di 15 cm dal fondo e deve essere segnato sul serbatoio per assicurare che il volume di acqua è coerente tra i topi. Il numero di carri armati dovrebbe idealmente essere almeno il doppio rispetto al numero di topi in fase di test alla volta, in modo che il secondo set serbatoio può essere riempito mentre il primo set è in uso. Le dimensioni dei serbatoi deve essere scelto in modo che i topi non sarà in grado di toccare il fondo della vasca, sia con i piedi o la coda, durante la prova di nuoto. L&#39;altezza del serbatoio dovrebbe essere abbastanza alta da evitare che i topi di uscire dalla vasca. Si prega di notareche il diametro del serbatoio e la profondità d&#39;acqua sono parametri importanti che possono essere regolati per modificare il comportamento dei topi (per un&#39;analisi dettagliata di questi temi vedi 1-3). 1.2. Termometro Un termometro a infrarossi resistente all&#39;acqua è preferibile, dal momento che la misurazione rapida della temperatura riduce la quantità di tempo necessario per effettuare il test. Tuttavia, un termometro di vetro a mercurio saranno sufficienti per questo compito. 1.3. Timer 1.4. Dispositivo di registrazione video Noi usiamo una videocamera sostenuto da un treppiede. Poiché questo test di solito comporta animali più in fase di sperimentazione allo stesso tempo, segnando dal vivo sarà molto difficile e non è consigliabile. La videocamera dovrebbe registrare in alta risoluzione basta per rendere un&#39;immagine di qualità che verrà usata in seguito per il punteggio comportamentali. Assicurarsi sempre che vi sia memoria sufficiente a registrare la fotocamera prima di starting il test. Noi usiamo una videocamera che registra in digitale senza l&#39;utilizzo di mezzi meccanici (cioè videocassetta), consentendo il trasferimento digitale di video. Se ci sono riflessioni eccessive sui carri armati, che possono verificarsi in ambienti di laboratorio con un sovraccarico di illuminazione fluorescente, si consiglia di utilizzare un filtro lente polarizzante con la fotocamera. 1.5. Divisori Nel nostro laboratorio abbiamo due serie di divisori (35 cm di altezza x 22 cm di larghezza x 22 cm di profondità). Queste sono rettangolari con tre pareti e vengono utilizzati sia come sfondo e come divisori tra serbatoi per evitare che i topi da vedersi durante il test e potenzialmente alterare i loro comportamenti. Un gruppo può essere di colore nero per gli animali albini e la luce, l&#39;altro gruppo può essere di colore chiaro per gli animali di colore scuro per rendere ad alto contrasto. Lo sperimentatore deve assicurarsi che le superfici dei divisori non sono eccessivamente riflettente in modo da alterare le immagini della videocamera, o rendere maggiore differences tra i livelli di illuminazione. 1.6. Generatore di rumore bianco Ciò è necessario in ambienti di laboratorio, in cui improvvisi rumori forti può essere sentito che potenzialmente spaventare gli animali. Il generatore di rumore si maschera come i suoni intermittenti inquietante. Il livello del volume del generatore di rumore bianco dovrebbero essere selezionati per essere al di sopra di altri rumori ambientali e inaspettato. Nella nostra stanza sperimentale il livello di rumore ambientale (senza il generatore di rumore bianco attivato) è di 60 dB. Il livello di rumore totale con il generatore di rumore bianco attivato nel punto in cui sono collocati i serbatoi è 70-72 dB. Tuttavia va notato che queste cifre sono forniti come esempio solo, e ogni laboratorio dovrebbe selezionare i livelli di rumore diritto in base al loro ambiente unico e le circostanze. 1.7. Carta asciugatura e lampada di calore Prima di tornare gli animali nelle loro gabbie a casa, è importante asciugaredelicatamente con carta da cucina ed è utile usare una lampada di calore (la temperatura è certa esposizione non superi i 32 ° C) per evitare l&#39;ipotermia. 2. Procedure comportamentali <ol><li> Il design complessivo sperimentale dovrebbe riflettere controbilanciare adeguato tra variabili specifiche per l&#39;esperimento. Per esempio, nei nostri esperimenti, cerchiamo di rappresentare ogni gruppo in modo uguale in ogni FST sessione (cioè, se ci sono quattro gruppi di trattamento, ognuno sarà rappresentata in ogni sessione). Inoltre, i topi vengono ruotati, in modo che i topi da ciascun gruppo di trattamento sono collocati in un diverso serbatoio in ogni sessione. </li><li> Collocare la fotocamera e i divisori in posizione. La fotocamera dovrebbe essere il più vicino possibile al fine di ottenere la massima risoluzione possibile dei topi. </li><li> I serbatoi devono essere riempiti con acqua di rubinetto fissato a temperatura ambiente (23-25 ​​° C) al livello determinato, che è segnato sulle pareti del serbatoio. Se la vostra struttura non ha costanti wa caldo / freddoter, si consiglia di preparare acqua calda e / o ghiaccio, per portare rapidamente l&#39;acqua alla giusta temperatura. Controllare la temperatura dell&#39;acqua con il termometro a raggi infrarossi. In alternativa, se le temperature di acqua calda e fredda sono costanti presso la vostra sede, è possibile disegnare sulla vasca due marchi - uno per il livello di acqua calda e un secondo segno per l&#39;aggiunta di acqua fredda - per avvicinarsi alla finale corretta temperatura dell&#39;acqua velocemente. </li><li> Avviare il generatore di rumore bianco, se utilizzato, prima che i topi vengono introdotti per la sala prove. Il livello di rumore bianco dovrebbe essere sufficiente per mascherare i rumori esterni. Evitare un alto volume e assicurarsi che lo stesso livello di rumore bianco viene utilizzato per tutti gli animali. </li><li> Portare gli animali in sala prove. Se la stanza colonia dove risiedono gli animali e la sala prove sono adiacenti o molto vicini tra loro, le condizioni ambientali sono simili e il disturbo durante la movimentazione della gabbia è minima, quindi non acclimatazione period sarà necessario. In caso contrario, luogo gli animali in sala prove per un periodo di acclimatazione (in genere almeno un&#39;ora). Se un periodo di acclimatazione è necessario assicurarsi che gli animali acclimatati non saranno interessati dai topi in fase di sperimentazione allo stesso tempo nella stessa stanza. Si prega di essere consapevole del fatto che stimoli olfattivi e ad ultrasuoni può essere percepito da altri animali collocato nella stessa stanza. </li><li> Avviare la registrazione video prima di mettere gli animali nei serbatoi d&#39;acqua. </li><li> Tenere l&#39;animale per la coda, e delicatamente e lentamente posto in acqua. Una volta che il topo è in acqua, rilasciare lentamente la coda. Tipicamente, utilizzando questa procedura impedirà la testa dell&#39;animale ad essere sommerso sotto l&#39;acqua. </li><li> Mettere i topi nei serbatoi di un ordine in cui l&#39;ostruzione della registrazione sarà ridotto al minimo. Questo ordine, naturalmente, dovrebbe essere decisa in collaborazione con il contrappeso di gruppi e altri requisiti specifici per il disegno sperimentale. </li><li>Una volta che tutti i topi sono nei serbatoi-avviare il conto alla rovescia sul cronometro. La lunghezza di prova usuale per i topi è di sei minuti nella FST. </li><li> Durante il test essere certi che sono ad una distanza ragionevole dagli animali e non fanno alcun movimento o rumore che può essere notato dagli animali. I topi possono facilmente galleggiare in acqua, tuttavia, se sia un nuovo ceppo di topi o di un nuovo composto in fase di sperimentazione, senza conoscenza del loro effetto sul comportamento di nuoto, lo sperimentatore dovrebbe monitorare più da vicino gli animali. A differenza di ratti, topi in genere non immergersi durante la FST, tuttavia in caso di immersioni con il mouse deve essere rimosso dal serbatoio. Se lo sperimentatore lascia la stanza i topi devono essere monitorati dal video nel caso in cui il mouse non può mantenere il nuoto e galleggianti comportamento e di interrompere il test se necessario. </li><li> Al termine del periodo di sei minuti di prova interrompere la registrazione. Nel nostro laboratorio, mostriamo una nota di fronte alla telecamera che identifica gli animali alla finedi ogni registrazione. Quando si utilizza questo approccio l&#39;individuo successivamente segnando la registrazione non si conosce l&#39;identità degli animali, dato che l&#39;identità viene mostrato solo alla fine della registrazione. Questo impedisce qualsiasi identificazione e registrazione dei problemi che possono verificarsi in seguito relativi alle registrazioni. Indipendentemente dalla strategia di conservazione dei documenti che viene utilizzato, si dovrebbe identificare chiaramente gli animali e anche impedire l&#39;individuo più tardi segnando la prova di avere conoscenza delle assegnazioni di gruppo. </li><li> Rimuovere gli animali dal mare per la coda nello stesso ordine che li metti dentro e asciugare delicatamente con carta di essiccazione e posto nuovamente dentro il loro homecage. </li></ol> 3. Analisi del comportamento <ol><li> La versione del mouse di FST è tipicamente, dall&#39;inizio alla fine, sei minuti. Tuttavia, in genere solo gli ultimi quattro minuti della prova vengono analizzati. Ciò è dovuto al fatto che la maggior parte dei mouse sono molto attivi all&#39;inizio della FST, e il pSUFFICIENTI effetti del trattamento possono essere oscurata durante i primi due minuti. </li><li> Nel nostro laboratorio abbiamo caricare i file video direttamente dalla fotocamera al PC e fare l&#39;analisi del PC. </li><li> Durante l&#39;analisi comportamentale, il tempo che ogni topi spende mobile è misurata. L&#39;importo totale del tempo la mobilità è poi sottratto i 240 secondi di tempo di prova e viene indicato come il tempo di immobilità. Mentre è possibile misurare il tempo di immobilità direttamente nel nostro laboratorio abbiamo trovato più facile da individuare e misurare i movimenti attivi, piuttosto che la mancanza di tali movimenti. </li><li> L&#39;aspetto più importante di analisi comportamentale e di solito la principale fonte di variabilità tra osservatori nel FST è la corretta identificazione dei movimenti che sono considerati come la mobilità in buona fede. La nostra definizione operativa per la mobilità nel FST è un qualsiasi movimenti diversi da quelli necessari per bilanciare il corpo e tenere la testa sopra l&#39;acqua 4. I topi di solito galleggiano in acqua facilmente, tuttavia esse tuttora esprimono piccoli movimenti di equilibrare i loro corpi e tenere la testa sopra l&#39;acqua. Questi comportamenti non sono un tentativo di fuga e non deve essere segnata come la mobilità. Inoltre, dopo una sessione singola di mobilità, anche se sostanzialmente immobile, i topi sono ancora alla deriva in acqua a causa della quantità di moto. Questi movimenti non dovrebbe essere segnata come la mobilità. </li><li> Nel nostro laboratorio, si usa sullo schermo cronometro software (Xnote cronometro, dnSoft Research Group) per misure di tempo. Due cronometri separati utilizzati sullo schermo. La prima cronometro conto alla rovescia a partire da 240 secondi e avverte l&#39;osservatore quando il periodo di analisi comportamentale finisce. Il secondo cronometro misura il tempo trascorso mobile. Alcuni software cronometro ha la capacità di assegnare tasti per avviare e interrompere le funzioni, in modo che sullo schermo cronometri può essere controllato tramite la tastiera. Nel nostro laboratorio, invece di una tastiera normale, si usa un dispositivo di input comunemente noto comeun &#39;gamepad&#39; di controllare i cronometri. </li><li> Quando si utilizza un PC per quantificare immobilità, se c&#39;è più di un topo testati e presenti sullo schermo, è una buona idea per coprire gli altri animali (si può usare un&#39;altra finestra del programma o fisicamente coprire lo schermo con carta), in modo che i loro movimenti non distrarre l&#39;osservatore. </li><li> Se sullo schermo cronometro viene utilizzato, essere certi di coprire tutti, ma i decimali millisecondo del cronometro. La ragione di questo è quello di evitare pregiudizi nell&#39;osservatore, pur consentendo la possibilità di determinare se l&#39;orologio è in esecuzione o non è in esecuzione. Dal momento che l&#39;osservatore, mentre cieco alle assegnazioni di gruppo degli animali, avrà una idea generale del livello di mobilità nei topi, ci potrebbero essere alcuni pregiudizi che si verificano se si è permesso di vedere il tempo totale trascorso per la mobilità del mouse particolare prima del completamento della sessione di analisi. Coprendo il cronometro, ha solo sapere se il cronometro è acceso o spento in qualsiasi momento, ma will non conosce il tempo totale trascorso e, pertanto, non può essere effettuata da ogni pregiudizio. </li><li> Inter-osservatore test di affidabilità deve essere condotto per ogni nuovo osservatore prima di iniziare a raccogliere i dati provenienti da animali di prova. Nel nostro laboratorio, ciascun osservatore nuovi orologi prima un punteggio esperto osservatore. Dopo la nuova fiducia guadagni osservatore per differenziare mobilità da immobilità, hanno poi punteggio con l&#39;osservatore esperto osservando e segnalando eventuali errori. Una volta che questa fase è completata con successo, il nuovo osservatore analizzerà uno specifico insieme di video FST che teniamo nel nostro laboratorio a scopo di addestramento. Solo dopo che un alto livello di inter-osservatore correlazione è ottenuta con l&#39;osservatore esperto fa un investigatore inizia l&#39;analisi video FST negli esperimenti reali. Noi archiviare i dati da queste analisi la formazione di costituire uno standard interno per il laboratorio per un uso futuro. Abbiamo osservato le differenze tra i ceppi nel modo in cui esprimono la mobilità (e immobilità) i comportamenti, e il tempo immobilità media tra i sessi. Quando un nuovo ceppo del mouse, il sesso, o geneticamente modificati modello viene testato in laboratorio, è necessario intraprendere questo nuovo tipo di analisi di affidabilità. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Ci sono notevoli differenze tra diversi ceppi di topi geneticamente inbred e outbred in termini di immobilità basale e rispondere a un farmaco specifico 5-11. Per esempio, abbiamo individuato differenziale antidepressivo-quali risposte a litio in un pannello di ceppi di topi (Figura 1) 5. Dettagli sperimentali di questo esperimento sono stati pubblicati a Can et al., 2011 5. <img src="/files/ftp_upload/3638/3638fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Immobilità tempo (in secondi) nel test di nuoto forzato, cinque ore dopo una singola iniezione ip di soluzione salina, 200, 300, o 400 mg / kg nei vari inbred e outbred ceppi di topi. *: P &lt;0,05, **: p &lt;0.01, ***: p &lt;0,001 denotano una differenza significativa rispetto al gruppo soluzione salina, test post hoc di Dunnett. I dati sono espressi come media ± SEM. Numero di animali per gruppo per ogni ceppo è 6-8 (Figura riprodotta da 5). Non tutti i ceppi di topi sono adatti per la FST. Alcuni ceppi, come Black svizzero, NIH svizzero e FVB / NJ mostrano poco o quasi immobilità in condizioni di controllo, e rappresenta quindi un effetto pavimento (Figura 1) 5. La mancanza di immobilità al basale previene efficacemente rilevato un effetto antidepressivo di manipolazioni sperimentali. E &#39;anche possibile, benché molto rari, che alcuni ceppi di topi possono comportarsi in modo aberrante e tuffarsi nel serbatoio durante la prova, anche se possono galleggiare. Una tale pressione è DBA/1OlaHsd (osservazione inedita nel nostro laboratorio). Tali ceppi non sono adatti per la FST. A causa di questo rischio immersioni, però Small, quando si verifica un nuovo ceppo, che non è stato precedentemente testato in FST o un mouse ospitare una manipolazione genetica romanzo, è imperativo di osservare con attenzione le prove iniziali di salvare i topi se si impegnano in comportamenti potenzialmente dannosi. Nel disegno sperimentale qui descritto, gli animali multipli (fino a cinque) sono testati al tempo stesso. Mentre i divisori che usiamo evitare i topi da vedersi durante la prova, e il generatore di rumore bianco sopprime vocalizzazioni udibili, il nostro set-up non impedisce tutte le indicazioni a ultrasuoni o olfattivi di essere trasmessi. Anche se improbabile, data la natura del test, questi potrebbero influenzare i comportamenti dei topi. Una soluzione a questo problema sarebbe quello di testare i singoli animali. Tuttavia, questo approccio ha i suoi problemi. Per esempio, comunemente, gli animali testati in ogni sessione provengono dalla homecage stesso. Ciò consente di randomizzazione e di controbilanciare le variabili sperimentali. Test individuali topiLy avrebbe significato la rimozione di un topo in un momento dal homecage. Questo farà sì che lo stress ripetuti e disturbi della gerarchia sociale nella gabbia tra gli altri lasciati alle spalle. Un altro problema con i test singolarmente sono i limiti di tempo. Test un mouse alla volta si estenderà l&#39;esperimento in molte ore che provocano una situazione in cui vengono testati i topi in momenti diversi del ciclo circadiano. Questo può creare confusione volta di effetti giorno. I ricercatori dovrebbero tenere a mente questi temi durante la progettazione i loro esperimenti.

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J., Clenet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+valuable+are+animal+models+in+defining+antidepressant+activity.">How valuable are animal models in defining antidepressant activity.</a> Human Psychopharmacology: Clinical and Experimental. 16, 9-21 (2001).</li></ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

La FST (a volte chiamato test nuotare Porsolt) è stato sviluppato prima per i ratti e poi modificato per topi da Porsolt e colleghi 12,13. In aggiunta a quanto sopra-descritto il protocollo di successo nel nostro laboratorio, una serie di modifiche largamente prova sottili sono stati pubblicati (vedi Hascoet e Bourin per una revisione completa 1). Si tratta di un test comunemente utilizzato per la valutazione dell&#39;efficacia di farmaci anti-depressivi e gli effetti di varie manipolazioni compor...

<ul><li> Serbatoi d&#39;acqua </li><li> Termometro </li><li> Timer </li><li> Videocamera </li><li> Generatore di rumore bianco (opzionale) </li><li> Asciugatura della carta </li></ul>

the mouse forced swim test

Il test di nuoto forzato è un test comportamentale roditori utilizzati per la valutazione dei farmaci antidepressivi, efficacia antidepressiva di nuovi composti, e le manipolazioni sperimentali che mirano a rendere o prevenire gli stati depressivi simile. I topi sono posti in una vasca trasparente inevitabile che si riempie con l&#39;acqua e il loro comportamento mobilità fuga relativo è misurato. Il test di nuoto forzato è semplice da effettuare in modo affidabile e che richiede minime attrezzature specializzate. Il successo del test di nuoto forzato richiede l&#39;osservanza di determinati dettagli procedurali e ridurre al minimo lo stress ingiustificato per i topi. Nella descrizione del protocollo e il video di accompagnamento, spieghiamo come condurre la versione del mouse di questo test con particolare attenzione ai trabocchetti potenziali che possono essere pregiudizievoli per l&#39;interpretazione dei risultati e come evitarli. Inoltre, abbiamo spiegato come i comportamenti manifestati nel test sono valutati.

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The Mouse Forced Swim Test

Il test di nuoto forzato è convalidato come un approccio sperimentale per valutare il potenziale efficacia antidepressiva nei roditori. Animali da laboratorio sono collocati in una vasca di acqua e fuga comportamento relativo alla mobilità è quantificato. Le procedure comuni per la versione del mouse di questa prova sono descritti.

La forzata mouse test Swim

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

104.7K Views.  University of Maryland School of Medicine. Il test di nuoto forzato è convalidato come un approccio sperimentale per valutare il potenziale efficacia antidepressiva nei roditori. Animali da laboratorio sono collocati in una vasca di acqua e fuga comportamento relativo alla mobilità è quantificato. Le procedure comuni per la versione del mouse di questa prova sono descritti.

Video: The Mouse Forced Swim Test

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-topo Imaging neuroanatomici Risonanza Magnetica

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Ricerca

Neuroscienze

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Rilevazione di placche neuritiche nel modello di malattia di Alzheimer mouse

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-labirinto alternanza forzata e sinistra-destra Attività discriminazione per la Valutazione di lavoro e la memoria di riferimento nel Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

The Tail Suspension Test

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that are expected to affect depression related behaviors. Mice are suspended by their tails with tape, in such a position that it cannot escape or hold on to nearby surfaces. During this test, typically six minutes in duration, the resulting escape oriented behaviors are quantified. The tail-suspension test is a valuable tool in drug discovery for high-throughput screening of prospective antidepressant compounds. Here, we describe the details required for implementation of this test with additional emphasis on potential problems that may occur and how to avoid them. We also offer a solution to the tail climbing behavior, a common problem that renders this test useless in some mouse strains, such as the widely used C57BL/6. Specifically, we prevent tail climbing behaviors by passing mouse tails through a small plastic cylinder prior to suspension. Finally, we detail how to manually score the behaviors that are manifested in this test.

The tail-suspension test is validated as an experimental procedure to assess antidepressant efficacy of drug treatments in mice. Mice are suspended by their tails for six minutes and escape-related behaviors are assessed. We describe procedures used in conducting the tail suspension test.

La coda di test Sospensione

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

La telomerasi attività nelle varie regioni del cervello di topo: telomerasi non radioattivo Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Analisi automatizzata di<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Utilizzando Celest Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Diffuse Reflectance Spectroscopy: Getting the Capillary Refill Test Under One's Thumb

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill should occur within 2 s after releasing 5 s of firm pressure (e.g., by the physician&#39;s finger) in the normal healthy supine patient. A slower refill time indicates poor skin perfusion, which can be caused by conditions including sepsis, blood loss, hypoperfusion, and hypothermia. Since its introduction, the clinical usefulness of the test has been debated. Advocates point out its feasibility and simplicity and claim that it can indicate changes in vascular status earlier than changes in vital signs such as heart rate. Critics, on the other hand, stress that the lack of standardization in how the test is performed and the highly subjective nature of the naked eye assessment, as well as the test&#39;s susceptibility to ambient factors, markedly lowers the clinical value. The aim of the present work is to describe in detail the course of the refill event and to suggest potentially more objective and exact endpoint values for the capillary refill test using diffuse polarization spectroscopy.

This protocol describes how the use of diffuse polarization spectroscopy can improve the clinical usefulness of the capillary refill test. We suggest a more detailed analysis of the course of the capillary refill in healthy volunteers using diffuse reflectance spectroscopy videos and new informatic endpoints.

Spettroscopia di riflettanza diffusa: Ottenere la prova di ricarica capillare sotto il pollice

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...