Este estudo foi apoiado pelo NIHM conceder R01 e R21 MH091816 MH084043 para TDG.

1. Materiais e Método 1.1. Os tanques de água Os tanques cilíndricos (30 cm de altura x 20 cm de diâmetro), necessários para o teste de natação forçada do mouse (FST) em nosso laboratório são feitas de acrílico transparente, como este material é capaz de suportar o movimento freqüente dos tanques e acidentes melhor do que o vidro. O nível da água é de 15 cm do fundo e devem ser marcadas no tanque para garantir que o volume de água é consistente em camundongos. O número de tanques deve ser idealmente, pelo menos, o dobro do número de ratos que está sendo testado em um momento, de modo que o conjunto segundo tanque de água pode ser preenchido enquanto o primeiro conjunto está em uso. As dimensões dos tanques devem ser selecionados de uma forma que os ratos não será capaz de tocar o fundo do tanque, ou com os pés ou os rabos, durante o teste de natação. A altura do tanque deve ser alta o suficiente para impedir os ratos de escapar do tanque. Por favor, noteque o diâmetro do tanque e da profundidade da água são parâmetros importantes que podem ser ajustadas para alterar o comportamento de camundongos (para uma análise detalhada dessas questões ver 1-3). 1.2. Termômetro Um termômetro infravermelho resistente à água é preferível, uma vez que a medição rápida da temperatura reduz a quantidade de tempo necessário para realizar o teste. No entanto, um copo termômetro de mercúrio também vai ser suficiente para esta tarefa. 1.3. Cronômetro 1.4. Dispositivo de gravação de vídeo Usamos uma câmera de vídeo suportado por um tripé. Dado que este teste geralmente envolve vários animais sendo testados ao mesmo tempo, marcando ao vivo vai ser muito difícil e não é aconselhável. A câmera de vídeo deve gravar em resolução alta o suficiente para tornar uma imagem de qualidade que será usada mais tarde para marcar comportamentais. Sempre verifique se há memória de gravação suficiente na câmara antes de starting o teste. Usamos uma câmera de vídeo que grava digitalmente, sem a utilização de meios mecânicos (vídeo cassete, por exemplo), permitindo a transferência digital de vídeos. Se houver excesso de reflexões sobre os tanques, que podem ocorrer em ambientes de laboratório com iluminação fluorescente em cima, você pode querer usar um filtro polarizador de lentes com a câmera. 1.5. Divisores Em nosso laboratório temos dois conjuntos de divisores (35 cm de altura x largura 22 cm x 22 cm de profundidade). Estas são retangulares, com três paredes e são utilizados como fundo e como divisores entre os tanques para evitar que os ratos de ver um ao outro durante o teste e, potencialmente, alterar os seus comportamentos. Um conjunto pode ser preto para albinos e luz animais coloridos; o outro conjunto pode ser de cor clara para escura animais coloridos para tornar de alto contraste. O experimentador deve se certificar de que as superfícies dos divisores não são excessivamente reflexivo de modo que eles alteram as imagens da câmera, ou tornar grandes differences entre os níveis de iluminação. 1.6. Gerador de ruído branco Isso é necessário em ambientes de laboratório em que súbitos ruídos altos podem ser ouvidos que potencialmente assustar os animais. O gerador de ruído irá mascarar tais sons intermitentes perturbador. O nível de volume do gerador de ruído branco devem ser selecionados para estar acima de outros ruídos do ambiente e inesperada. Na nossa sala experimental, o nível de ruído ambiente (sem o gerador de ruído branco ativado) é de 60 dB. O nível de ruído total com o gerador de ruído branco ativado no local onde os tanques são colocados é 70-72 dB. No entanto deve-se notar que estes números são fornecidos como exemplo apenas, e cada laboratório deve selecionar os níveis de ruído direito de acordo com seu ambiente único e circunstâncias. 1.7. Papel secante e lâmpada de calor Antes de retornar os animais para suas gaiolas de casa, é importante secar-as delicadamente com toalhas de papel e é útil usar uma lâmpada de calor (a temperatura estar certos de que a exposição não exceda 32 ° C) para evitar a hipotermia. 2. Procedimentos comportamentais <ol><li> O projeto total experimental deve refletir contrabalançando adequado entre variáveis ​​específicas de seu experimento. Por exemplo, em nossos experimentos, tentamos representar cada grupo igualmente em todos os FST sessão (ou seja, se existem quatro grupos de tratamento, cada um será representado em cada sessão). Além disso, os ratos são rodados, tais que os ratos de cada grupo de tratamento são colocados em um tanque diferente em cada sessão. </li><li> Coloque a câmera e os divisores na posição. A câmera deve ser o mais próximo possível, a fim de obter a maior resolução possível dos ratos. </li><li> Os tanques deverão ser preenchidos com água da torneira set na temperatura ambiente (23-25 ​​° C) até o nível determinado, que é marcado nas paredes do tanque. Se sua instalação não tem wa quente / frio constanteter, você pode querer preparar a água quente e / ou gelo rapidamente trazer a água à temperatura certa. Verifique a temperatura da água com o termômetro infravermelho. Alternativamente, se as temperaturas de água quente e fria são constantes em suas instalações, você pode desenhar no tanque de duas marcas - uma para o nível de água quente e uma segunda marca para a adição de água fria - para chegar perto da final correta temperatura da água rapidamente. </li><li> Iniciar o gerador de ruído branco, se a ser utilizado, antes de os ratos são introduzidos para a sala de testes. O nível de ruído branco só deve ser suficiente para mascarar ruídos externos. Evitar um alto volume e certifique-se o mesmo nível de ruído branco está sendo usado para todos os animais. </li><li> Trazer os animais para a sala de testes. Se a sala de colônia onde os animais residem e sala de ensaios são adjacentes ou muito próximos uns dos outros, as condições ambientais são semelhantes e os distúrbios durante o movimento da gaiola é mínima, então nenhum de aclimatação period será necessário. Caso contrário, colocar os animais na sala de ensaio durante um período de aclimatação (geralmente pelo menos uma hora). Se um período de aclimatação é necessária, certifique-se que os animais aclimatados não serão afetados pelos ratos sendo testados ao mesmo tempo na mesma sala. Por favor, esteja ciente de que pistas olfativas e ultra-som pode ser percebido pelos outros animais colocados na mesma sala. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo antes de colocar os animais para os tanques de água. </li><li> Segurar o animal pelo rabo, e com cuidado e lentamente lugar na água. Uma vez que os camundongos está na água, liberam lentamente a cauda. Geralmente, usando este procedimento impedirá a cabeça do animal de ser submersa na água. </li><li> Coloque os ratos nos tanques em uma ordem na qual a obstrução de gravação será minimizado. Nesta ordem, é claro, deve ser decidido em conjunto com o contrapeso de grupos e outras exigências específicas para o seu projeto experimental. </li><li>Uma vez que todos os ratos estão em tanques-start a contagem regressiva no cronômetro. O comprimento de teste usual para camundongos é de seis minutos no FST. </li><li> Durante o teste ter certeza que você está a uma distância razoável dos animais e não fazer qualquer movimento ou ruído que pode ser notado pelos animais. Ratos podem facilmente flutuar na água, no entanto, se qualquer uma nova cepa de camundongos ou de um novo composto que está sendo testado, sem conhecimento prévio de seu efeito sobre o comportamento de natação, o experimentador deve monitorar os animais mais de perto. Em contraste com ratos, camundongos normalmente não mergulhar durante o FST, no entanto em caso de mergulho com o mouse devem ser retirados do tanque. Se o experimentador deixa a sala os ratos devem ser monitorados por vídeo, no caso de um rato não pode manter a natação e flutuação comportamento e para parar o teste, se necessário. </li><li> No final do período de seis minutos de teste parar a gravação. Em nosso laboratório, nós mostramos uma nota na frente da câmera que identifica os animais no finalde cada gravação. Ao usar esta abordagem o indivíduo posteriormente marcar a gravação não conhecer a identidade dos animais desde a identidade só é mostrado no final da gravação. Isso impede que qualquer identificação e registro de problemas que podem ocorrer mais tarde relacionadas com as gravações. Independentemente da estratégia de manutenção de registros que está sendo usado, ele deve identificar claramente os animais e também impedir o indivíduo depois de marcar o teste de ter conhecimento de trabalhos em grupo. </li><li> Retire os animais da água por suas caudas na mesma ordem em que você colocá-los em e gentilmente secá-las com um papel de secagem e coloque de volta para sua homecage. </li></ol> 3. Análise do Comportamento <ol><li> A versão do rato do FST é tipicamente, do início ao fim, seis minutos de duração. No entanto, geralmente apenas os últimos quatro minutos do teste são analisados. Isto é devido ao fato de que a maioria dos mouses são muito ativos no início do FST, e os pOTENCIAL efeitos do tratamento pode ser obscurecida durante os primeiros dois minutos. </li><li> Em nosso laboratório nós fazer o upload dos arquivos de vídeo diretamente da câmera para um PC e fazer a análise sobre o PC. </li><li> Durante a análise comportamental, o tempo que cada um gasta ratos móvel é medido. A quantidade total de tempo de mobilidade é então subtraído os 240 segundos de tempo de teste e em seguida é indicado como o tempo de imobilidade. Embora seja possível medir o tempo de imobilidade diretamente, em nosso laboratório temos encontrado mais fácil de detectar e medir movimentos ativos e não a falta de tais movimentos. </li><li> O aspecto mais importante da análise comportamental e, geralmente, a maior fonte de variabilidade entre os observadores na FST é a identificação correta de movimentos que são contados como a mobilidade de boa-fé. Nossa definição operacional para a mobilidade na FST é qualquer movimento para além dos necessários para equilibrar o corpo e manter a cabeça acima da água 4. Camundongos geralmente flutuam na água facilmente, no entanto eles ainda manifestam pequenos movimentos para equilibrar o corpo e manter a cabeça acima da água. Esses comportamentos não são uma tentativa de fuga e não deve ser classificada como de mobilidade. Além disso, após uma simples sessão de mobilidade, embora essencialmente imóvel, camundongos ainda podem drift na água como resultado de impulso. Esses movimentos também não deve ser classificada como de mobilidade. </li><li> Em nosso laboratório, nós usamos um cronômetro na tela software (XNote cronômetro, dnSoft Research Group) para medições de tempo. Dois cronômetros separados são usados ​​na tela. O cronômetro primeiro faz a contagem regressiva de 240 segundos e alerta o observador quando o período de análise comportamental termina. O segundo cronômetro mede o tempo gasto móvel. Alguns softwares cronômetro tem a capacidade de atribuir teclas para iniciar e parar funções, de modo que na tela cronômetros pode ser controlado pelo teclado. Em nosso laboratório, em vez de um teclado normal, nós usamos um dispositivo de entrada comumente conhecido comoum &quot;gamepad&quot; para controlar os cronômetros. </li><li> Ao usar um PC para quantificar imobilidade, se houver mais de um rato testados e apresentar na tela, é uma boa idéia para cobrir os outros animais (você pode usar outra janela do programa ou fisicamente cobrir a tela com papel), para que seus movimentos não vai distrair o observador. </li><li> Se um cronômetro na tela é usado, é certo, mas para cobrir todos os decimais milissegundo do cronômetro. A razão para isto é para evitar o viés do observador, permitindo ainda a capacidade de determinar se o relógio está a correr ou não correr. Uma vez que o observador, enquanto cego para as atribuições do grupo dos animais, terá uma idéia geral do nível de mobilidade nos ratos, pode haver algum viés que ocorre se ela tem permissão para ver a quantidade total de tempo decorrido para que a mobilidade especial do mouse antes da conclusão da sessão de análise. Cobrindo o cronômetro, ela só vai saber se o cronômetro é ligado ou desligado a qualquer momento, mas will Não sei o tempo total decorrido e, portanto, não pode ser efectuada por qualquer preconceito. </li><li> Uma inter-observador teste de confiabilidade deve ser realizado para cada novo observador antes de começar a coletar dados de animais de laboratório. Em nosso laboratório, cada novo observador primeira relógios marcando um observador experiente. Após o novo observador ganha confiança para diferenciar a mobilidade da imobilidade, eles então pontuação com o observador experiente observando e apontando os erros. Uma vez que esta fase é concluída com êxito, o novo observador vai analisar um conjunto específico de vídeos FST que mantemos em nosso laboratório para fins de treinamento. Só depois de um alto nível de correlação inter-observador é obtida com o observador experiente faz um investigador começar analisando vídeos FST em experimentos reais. Nós arquivar os dados dessas análises de treinamento para constituir um padrão interno para o laboratório para uso futuro. Temos observado diferenças entre as linhagens na maneira pela qual eles expressam mobilidade (e imobilidade) comportamentos, e tempo de imobilidade média entre os sexos. Quando um modelo novo mouse tensão, sexo, ou geneticamente modificados é testado em laboratório é necessário novamente realizar este tipo de análise de confiabilidade. </li></ol> 4. Resultados representante Há grandes diferenças entre linhagens de camundongos geneticamente distintas puras e outbred em termos de sua imobilidade inicial e respondendo a uma droga específica 5-11. Por exemplo, identificamos diferencial tipo antidepressivo respostas ao lítio em um painel de cepas de mouse (Figura 1) 5. Detalhes experimentais desta experiência são publicados em Can et al., 2011 5. <img src="/files/ftp_upload/3638/3638fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Tempo de imobilidade (em segundos) no teste de natação forçada, cinco horas após uma única injeção ip de salina, 200, 300 ou 400 mg / kg em várias linhagens e outbred linhagens de camundongos. *: P &lt;0,05, **: p &lt;0,01, ***: p &lt;0,001 denotar uma diferença significativa quando comparado ao grupo salina, teste post hoc de Dunnett. Os dados são expressos como média ± SEM. Número de animais por grupo para cada estirpe é 6-8 (Figura reproduzida a partir de 5). Nem todas as linhagens de camundongos são adequados para o FST. Algumas cepas, como Black suíço, suíça NIH, e FVB / NJ mostram pouco ou quase imobilidade não em condições de controle, portanto, representa um efeito de solo (Figura 1) 5. A falta de imobilidade de base efetivamente impede a detecção de um efeito anti-depressivo de manipulações experimentais. Também é possível, embora muito raro, que algumas linhagens de camundongos podem se comportar aberrante e mergulhar no tanque durante o teste, mesmo que possa flutuar. Uma cepa como é DBA/1OlaHsd (observação não publicada em nosso laboratório). Essas cepas não são adequados para o FST. Devido a este risco de mergulho, no entanto small, ao testar uma nova estirpe que não tenha sido previamente testado no FST ou um mouse abrigar uma manipulação genética romance, é imperativo observar atentamente os primeiros testes para resgatar os ratos se engajar em comportamentos potencialmente prejudiciais. No projeto experimental aqui descrito, vários animais (até cinco) são testados ao mesmo tempo. Enquanto os divisores usamos ratos evitar de ver um ao outro durante o teste, eo gerador de ruído branco suprime vocalizações audíveis, o nosso set-up não impede que todos os sinais ultra-sônicos ou olfativa de serem transmitidas. Embora improvável, dada a natureza do teste, estes podem afetar o comportamento dos camundongos. Uma solução para este problema seria testar os animais individualmente. No entanto, esta abordagem tem seus próprios problemas. Por exemplo, comumente, os animais testados em cada sessão vem da homecage mesmo. Isto permite a randomização e contrabalançando das variáveis ​​experimentais. Testes individuais ratosly significaria a remoção de um rato em um momento da homecage. Isso fará com que o estresse repetido e perturbação da hierarquia social na gaiola entre os outros para trás. Outro problema com os testes individualmente são as limitações de tempo. Testando um rato em um momento vai estender a experiência em muitas horas, resultando em uma situação em que os ratos são testados em diferentes momentos do ciclo circadiano. Isto pode criar confusão tempo dos efeitos dia. Os pesquisadores devem manter estas questões em mente ao projetar seus experimentos.

<ol>
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Autores declaram que não há conflitos de interesse.

O FST (às vezes chamado de teste de natação Porsolt) foi desenvolvido em primeiro lugar para os ratos e depois modificado para camundongos por Porsolt e colegas 12,13. Além do protocolo acima descrito sucesso em nosso laboratório, uma série de modificações em grande parte testar sutis têm sido publicados (ver Hascoët e Bourin para uma revisão completa 1). É um teste comum usado para a avaliação da eficácia de anti-depressivos e os efeitos das várias manipulações comportamentais e ...

<ul><li> Tanques de água </li><li> Termômetro </li><li> Cronômetro </li><li> Filmadora </li><li> Gerador de ruído branco (opcional) </li><li> Secagem de papel </li></ul>

the mouse forced swim test

O teste de natação forçada é um teste comportamental de roedores utilizados para a avaliação de medicamentos antidepressivos, eficácia antidepressiva de novos compostos, e manipulações experimentais que visam a prestação ou impedindo-depressiva como estados. Os ratos são colocados em um tanque transparente inescapável que é preenchido com água e sua fuga comportamento de mobilidade relacionados é medido. O teste de natação forçada é simples de realizar de forma confiável e requer equipamento especializado mínimo. Implementação bem sucedida do teste de natação forçada exige a adesão a certos detalhes processuais e de minimização do estresse injustificado para os ratos. Na descrição do protocolo e que acompanha o vídeo, explicamos como conduzir a versão do mouse deste teste, com ênfase em armadilhas potenciais que podem ser prejudiciais à interpretação dos resultados e como evitá-los. Além disso, explicamos como os comportamentos manifestados no teste são avaliados.

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The Mouse Forced Swim Test

O teste de natação forçada é validado como uma abordagem experimental para avaliar a eficácia do antidepressivo potencial em roedores. Animais experimentais são colocados em um tanque de água e fugir de comportamentos relacionados à mobilidade é quantificado. Os procedimentos comuns para a versão do mouse deste teste são descritos.

O Mouse Teste de Natação Forçada

The forced swim test is a rodent behavioral test used for evaluation of antidepressant drugs, antidepressant efficacy of new compounds, and experimental ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

104.7K visualizações.  University of Maryland School of Medicine. O teste de natação forçada é validado como uma abordagem experimental para avaliar a eficácia do antidepressivo potencial em roedores. Animais experimentais são colocados em um tanque de água e fugir de comportamentos relacionados à mobilidade é quantificado. Os procedimentos comuns para a versão do mouse deste teste são descritos.

Vídeo: The Mouse Forced Swim Test

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-maze Alternância forçado e Tarefas esquerda-direita para a Avaliação da Discriminação de Trabalho e Memória de Referência em Ratos

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparação do tecido e imunocoloração de Fibras nervosas sensoriais que inervam rato da Pele e Ossos Limb

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

The Tail Suspension Test

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that are expected to affect depression related behaviors. Mice are suspended by their tails with tape, in such a position that it cannot escape or hold on to nearby surfaces. During this test, typically six minutes in duration, the resulting escape oriented behaviors are quantified. The tail-suspension test is a valuable tool in drug discovery for high-throughput screening of prospective antidepressant compounds. Here, we describe the details required for implementation of this test with additional emphasis on potential problems that may occur and how to avoid them. We also offer a solution to the tail climbing behavior, a common problem that renders this test useless in some mouse strains, such as the widely used C57BL/6. Specifically, we prevent tail climbing behaviors by passing mouse tails through a small plastic cylinder prior to suspension. Finally, we detail how to manually score the behaviors that are manifested in this test.

The tail-suspension test is validated as an experimental procedure to assess antidepressant efficacy of drug treatments in mice. Mice are suspended by their tails for six minutes and escape-related behaviors are assessed. We describe procedures used in conducting the tail suspension test.

O Teste de Suspensão da cauda

The tail-suspension test is a mouse behavioral test useful in the screening of potential antidepressant drugs, and assessing of other manipulations that ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Diffuse Reflectance Spectroscopy: Getting the Capillary Refill Test Under One's Thumb

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill should occur within 2 s after releasing 5 s of firm pressure (e.g., by the physician&#39;s finger) in the normal healthy supine patient. A slower refill time indicates poor skin perfusion, which can be caused by conditions including sepsis, blood loss, hypoperfusion, and hypothermia. Since its introduction, the clinical usefulness of the test has been debated. Advocates point out its feasibility and simplicity and claim that it can indicate changes in vascular status earlier than changes in vital signs such as heart rate. Critics, on the other hand, stress that the lack of standardization in how the test is performed and the highly subjective nature of the naked eye assessment, as well as the test&#39;s susceptibility to ambient factors, markedly lowers the clinical value. The aim of the present work is to describe in detail the course of the refill event and to suggest potentially more objective and exact endpoint values for the capillary refill test using diffuse polarization spectroscopy.

This protocol describes how the use of diffuse polarization spectroscopy can improve the clinical usefulness of the capillary refill test. We suggest a more detailed analysis of the course of the capillary refill in healthy volunteers using diffuse reflectance spectroscopy videos and new informatic endpoints.

Espectroscopia de reflectância difusa: Ficando o teste capilar sob o polegar

The capillary refill test was introduced in 1947 to help estimate circulatory status in critically ill patients. Guidelines commonly state that refill ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Localização do Locus Coeruleus no cérebro do rato

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...