Il protocollo di analisi della citotossicità che utilizza linee cellulari di zebrafish può rispondere a domande riguardanti la tossicità acuta delle sostanze chimiche sui pesci o aiutare a definire le concentrazioni di test appropriate per altri saggi alternativi sui pesci. Il vantaggio principale di questo test su piastre a 96 pozzetti è la combinazione di diversi endpoint di vitalità per determinare la citotossicità per le cellule di zebrafish, che è un'importante specie ittica negli studi di ecotossicità. Il protocollo è molto semplice.
Se segui correttamente tutti i passaggi descritti, non dovresti riscontrare alcun problema. Questo protocollo aiuta a non ottenere studi di ecotossicità basati sugli animali che valutino gli effetti nelle linee cellulari di pesce derivate da diversi organi o fasi di vita come gli epatociti nelle cellule embrionali. Per iniziare a placcare le celle ZEM2S o ZFL, calcolare il volume delle rispettive sospensioni cellulari necessarie per ottenere il numero desiderato di cellule per i saggi.
Riempire un serbatoio di reagente sterile con il terreno di coltura completo per la linea cellulare corrispondente e trasferire il volume calcolato della sospensione cellulare al serbatoio per un volume totale di 20 millilitri. Utilizzando una pipetta multicanale, mescolare delicatamente la soluzione su e giù senza formare schiuma o bolle. Quindi, utilizzando la micropipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra trasparente in polistirene a 96 pozzetti per ottenere un conteggio delle cellule vitali di 60.000 cellule per pozzetto per le celle ZEM2S e 40.000 celle per pozzetto per le celle ZFL.
Incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 24 ore. Per esporre entrambi i tipi di cellule a diverse concentrazioni delle sostanze chimiche in esame, preparare la concentrazione desiderata di soluzioni chimiche in esame nei terreni di coltura per la linea cellulare di interesse senza siero fetale bovino o FBS. Dopo l'incubazione di 24 ore, scartare con attenzione i mezzi esausti dai pozzetti utilizzando una micropipetta multicanale.
Quindi aggiungere 100 microlitri di una particolare soluzione chimica di prova per pozzetto in triplicati tecnici, il che significa tre pozzetti per ogni concentrazione chimica di prova. Posizionare i gruppi di controllo sulla stessa piastra delle sostanze chimiche in esame in triplicati tecnici. Per il controllo del bianco, aggiungere 100 microlitri del mezzo di esposizione in tre pozzetti privi di celle.
Per il controllo negativo, aggiungere 100 microlitri del mezzo di esposizione a tre pozzetti contenenti cellule. Per il controllo positivo, esporre tre pozzetti contenenti cellule a una soluzione di Triton X-100 all'1% preparata nei mezzi di esposizione. Sigillare le piastre con parafilm o pellicola sigillante adesiva per evitare l'evaporazione del terreno di coltura e incubare le piastre a 28 gradi Celsius per 24 ore.
Dopo 24 ore dall'esposizione alla sostanza chimica di prova, scartare con attenzione i supporti di esposizione dai pozzetti versando il contenuto in un vassoio di raccolta e lavare ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS. Quindi, per rimuovere il PBS senza perdere cellule, versarlo con cura in un vassoio di raccolta. Per eseguire i saggi Alamar Blue o AB e CFDA-AM, aggiungere 100 microlitri della rispettiva soluzione per pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti al buio a 28 gradi Celsius.
Successivamente, misurare la fluorescenza in un lettore di piastre a fluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate menzionate nel testo. Per eseguire il test rosso neutro o NR, prendere la soluzione di lavoro NR con una concentrazione di 40 microgrammi per millilitro e centrifugare a 600 G per 10 minuti. Quindi, rimuovere con attenzione le soluzioni AB e CFDA-AM precedentemente aggiunte dai pozzetti versando il contenuto in un vassoio di raccolta.
Utilizzando una micropipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri della soluzione di lavoro NR per pozzetto e incubare la piastra a 28 gradi Celsius per tre ore. Una volta terminata l'incubazione, versare con cura la soluzione NR dalla piastra in un vassoio di raccolta e lavare i pozzetti aggiungendo 150 microlitri di PBS per pozzetto. Dopo il lavaggio, aggiungere 150 microlitri della soluzione di estrazione NR per pozzetto e incubare la piastra agitandola delicatamente su uno scuotitore per 10 minuti prima di misurare l'assorbanza a 540 nanometri utilizzando un lettore di piastre.
Per eseguire il test MTT, dopo l'esposizione chimica di prova di 24 ore, rimuovere con attenzione il supporto di esposizione versando il contenuto in un vassoio di raccolta e utilizzando una micropipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di soluzione di lavoro MTT per pozzetto al buio. Incubare la piastra a 28 gradi Celsius per quattro ore al buio. Quindi scartare la soluzione MTT versando il contenuto in un vassoio di raccolta e aggiungere 100 microlitri di DMSO in ciascun pozzetto per estrarre i cristalli di formazan.
Incubare la piastra su uno scuotitore per 10 minuti prima di misurare l'assorbimento a 517 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Per il test AP, i pozzetti corrispondenti al controllo bianco, al controllo positivo e alle concentrazioni altamente citotossiche delle sostanze chimiche in esame hanno mostrato un colore blu e una bassa fluorescenza che indicano l'assenza o una riduzione delle cellule vitali. Al contrario, i pozzetti corrispondenti a basse concentrazioni citotossiche della sostanza chimica in esame e al controllo negativo contenenti un elevato numero di cellule vitali hanno convertito la resazurina in resorufin rosa con fluorescenza più elevata.
Per il test NR, le concentrazioni altamente citotossiche delle sostanze chimiche in esame e il controllo positivo sono trasparenti o rosa pallido con bassa assorbanza, mentre i pozzetti contenenti cellule vitali che conservano il colorante NR hanno mostrato un colore rosa scuro e un'elevata assorbanza. Allo stesso modo, per il test MTT, i pozzetti senza cellule vitali sono trasparenti, mentre quelli contenenti cellule vitali trasformano MTT in formazan di colore viola. Sulla base delle percentuali di vitalità cellulare calcolate, la concentrazione massima di inibitori o valore IC50 è stata stimata per le diverse sostanze chimiche in esame nelle linee cellulari ZFL e ZEM2S.
Non è stata osservata alcuna differenza significativa nella vitalità cellulare per le colture con e senza FBS, indicando l'idoneità dei terreni di coltura privati di FBS per il periodo di esposizione chimica di 24 ore. I test MTT e NR non hanno mostrato alcun effetto significativo della variazione delle concentrazioni di DMSO dallo 0,1% all'1% sulla vitalità cellulare, indicando che queste linee cellulari supportano l'uso di DMSO come solvente fino all'1%Prestare particolare attenzione durante la manipolazione delle cellule placcate per evitare l'autodistacco durante l'intera procedura e preparare con cura la soluzione di lavoro rosso neutro per evitare qualsiasi precipitazione del colorante. Questa procedura può essere applicata a studi che affrontano diversi aspetti degli effetti chimici sui pesci utilizzando modelli in vitro e contribuire al progresso di studi di ecotossicità basati su animali.
