Il nostro metodo aiuta a generare e comprendere i dati di espressione genica da tessuti complessi a livello di singola cellula. Il nostro metodo può essere applicato praticamente a qualsiasi tessuto allo stesso modo e porta a dati di alta qualità con pochissimi artefatti relativi al protocollo. La dottoressa Janna Leiz e io del laboratorio Schmidt-Ott presenteremo il protocollo.
Inizia posizionando il rene su una piastra di dissezione fredda e usa un bisturi affilato o una lama di rasoio per ottenere una fetta centrale da uno a due millimetri. Assicurarsi che il pezzo di tessuto contenga l'intero asse corticomemidollare. Utilizzare forbici e pinze per microdissezione per tagliare con cura la corteccia dai lati del pezzo centrale.
All'interno del pezzo di tessuto sezionato, i tre segmenti corteccia, midollo esterno e midollo interno dovrebbero essere chiaramente visibili. Trasferire il pezzo di rene nella soluzione di stabilizzazione dell'RNA precedentemente preparata e incubare per 24 ore a quattro gradi Celsius per evitare la degradazione dell'RNA. Dopo 24 ore, rimuovere la soluzione di stabilizzazione dell'RNA.
Rimuovere con cautela la soluzione in eccesso con una carta velina e conservare il tessuto a meno 80 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Prendi il pezzo di rene congelato e trasferiscilo in una piastra di Petri di polistirene pre-raffreddata da 60 millimetri su ghiaccio contenente un millilitro di Nuclei Lysis Buffer 1 o NLB1. Tritare accuratamente i tessuti usando una lama di rasoio o un bisturi.
Tagliare la punta di una punta di pipetta da un millilitro e trasferire il tessuto tritato e il tampone nel tubo di macinazione posto sul ghiaccio. Assicurandosi che tutti i pezzi siano stati trasferiti, lavare la capsula di Petri da cinque a 10 volte con il tampone. Spostare lentamente il pestello A 25 volte su e giù nel tubo del macinino sul ghiaccio per omogeneizzare la sospensione.
Far passare l'omogenato attraverso un filtro da 100 micrometri in un tubo di raccolta preraffreddato da 15 millilitri su ghiaccio e lavare il filtro con un altro millilitro di NLB1. Lavare il tubo della smerigliatrice con tampone di lisi a freddo per nuclei EZ e scartare il tampone. Trasferire nuovamente l'omogenato nel tubo della smerigliatrice e spostare lentamente il pestello B 15 volte su e giù nel tubo del macinino sul ghiaccio per omogeneizzare la sospensione.
Trasferire l'omogenato in un tubo di raccolta preraffreddato da 15 millilitri su ghiaccio. Lavare il tubo della smerigliatrice con altri due millilitri di NLB1 e assicurarsi di trasferire tutti i frammenti di tessuto nel tubo di raccolta. Incubare l'omogenato per cinque minuti sul ghiaccio per lisare le cellule.
Passare l'omogenato attraverso un filtro da 40 micrometri in un tubo di raccolta pre-raffreddato da 15 millilitri. Ruotare il tubo di raccolta per cinque minuti a 500 volte G a quattro gradi Celsius in una centrifuga con rotore a benna oscillante. Nel frattempo, aggiungere la soluzione di inibitori della RNasi a NLB2.
Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere con cautela il pellet in quattro millilitri di NLB2. Coprire con cura la sospensione con un cuscino da un millilitro di tampone sfumato di saccarosio.
Ruotare la sospensione a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga con rotore a benna oscillante. Nel frattempo, aggiungere la soluzione di inibitore della RNasi al tampone di sospensione dei nuclei. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente il tubo di raccolta dalla centrifuga, facendo attenzione a non disturbare i due strati durante la manipolazione del tubo di raccolta.
I detriti cellulari possono essere osservati tra i due strati. Rimuovere accuratamente il surnatante a partire dai detriti. Rimuovere il surnatante rimanente senza disturbare il pellet di nuclei e risospendere con attenzione il pellet in un millilitro di tampone di sospensione dei nuclei.
Far passare l'omogenato attraverso un filtro da 20 micrometri nel tubo di raccolta della selezione cellulare pre-raffreddato da cinque millilitri attivato dalla fluorescenza. Il numero di geni è stato tracciato rispetto al numero di trascritti definiti da identificatori molecolari univoci e colorati dalla frazione di letture mitocondriali per valutare la qualità dei nuclei isolati. Un totale di 20.000 geni sono stati rilevati in 6.000 nuclei con 1.600 geni mediani e 2.800 identificatori molecolari univoci mediani per nucleo.
I modelli di espressione genica dei marcatori arricchiti di cluster sono stati visualizzati utilizzando un dot plot e i cluster di tipo cellulare in un grafico di incorporamento stocastico del vicino distribuito a T. La percentuale di ciascun tipo di cellula è stata calcolata e utilizzata per determinare il rapporto tra tubulo prossimale e cellule degli arti ascendenti spesse. È fondamentale lavorare sempre a quattro gradi Celsius e determinare la quantità ottimale di tessuto durante le prove per garantire sospensioni di alta qualità e concentrazioni ottimali.
